蘇云金桿菌高效殺蟲工程菌的構(gòu)建及其伴胞晶體形成機(jī)制研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)作為一種環(huán)境友好型生物殺蟲劑，對(duì)靶標(biāo)害蟲具有專一的殺蟲活性，因此被廣泛使用于農(nóng)林業(yè)蟲害以及蚊媒傳播疾病的控制。它的殺蟲特性主要來源于在芽胞形成期大量產(chǎn)生的殺蟲活性蛋白。盡管在生態(tài)環(huán)境保護(hù)方面具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，但Bt生物殺蟲劑的使用仍然落后于合成的化學(xué)農(nóng)藥。對(duì)Bt菌株進(jìn)行遺傳改良，可為發(fā)展新型Bt生物殺蟲劑產(chǎn)品提供更好的技術(shù)與菌種資源。
　　 為獲得毒力更高

2、、殺蟲譜更廣的Bt菌株，進(jìn)一步擴(kuò)展Bt殺蟲劑在生物防治上的應(yīng)用，本研究采用分子手段，利用Bt偏愛密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)了昆蟲特異的鈣離子通道阻斷劑基因ω-ACTX-Hvla，并進(jìn)行化學(xué)合成，與殺蟲晶體蛋白基因crylAc3'-端融合，在Bt中進(jìn)行共表達(dá)，并研究了融合蛋白的晶體形成情況和生物活性功能。在Bt殺蟲蛋白基因crylAc的強(qiáng)表達(dá)體系調(diào)控下，crylAc、ω-ACTX-Hvla和綠色熒光蛋白基因egfp在Bt無晶體突變株Cry-B中得到了

3、有效的融合表達(dá)。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bt融合基因工程菌Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)的單個(gè)菌體中形成了2-3個(gè)較小的類似伴胞晶體的包涵體，在菌體裂解后仍然是穩(wěn)定的。在對(duì)Bt工程菌表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行的免疫雜交分析中，全長166kDa的融合蛋白帶被清晰的檢測(cè)到，說明融合基因可以在Bt中進(jìn)行完整的表達(dá)。通過對(duì)工程菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行生物活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)融合蛋白晶體對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的毒力比CrylAc晶體提高了至少5倍，對(duì)棉鈴蟲幼蟲也具有很高的毒力且

4、明顯抑制了幼蟲的生長。這些結(jié)果說明，外源殺蟲蛋白可以采取與Cry類內(nèi)毒素C-端融合的方式在Bt中共表達(dá)，共同形成伴胞晶體，并至少保留部分殺蟲生物活性。本研究為構(gòu)建具有不同殺蟲特性的融合蛋白以及構(gòu)建高效廣譜的Bt工程菌株奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 目前，研究者們雖然對(duì)cry基因的表達(dá)調(diào)控已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究，但由于在細(xì)菌活體中觀察Cry蛋白的聚集過程比較困難，缺乏好的檢測(cè)手段，因此人們對(duì)此類蛋白晶體形成的機(jī)制仍然很不清楚。本研究以Bt融

5、合基因工程菌Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)為研究對(duì)象，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)芽胞期菌體的蛋白晶體形成過程進(jìn)行了連續(xù)時(shí)間段的觀察。觀察結(jié)果顯示，融合蛋白開始表達(dá)時(shí)是散布于母細(xì)胞內(nèi)的，晶體形成是一個(gè)由蛋白分子從分散到逐漸聚集的一個(gè)過程，并且蛋白的聚集位點(diǎn)存在極性，靠近菌體兩端。菌體裂解前，融合蛋白形成的晶體顆粒體積達(dá)到最大。本研究構(gòu)建的Cry蛋白可視化分析系統(tǒng)在細(xì)胞水平上為深入研究殺蟲蛋白晶體的組裝與形成機(jī)制提供了非常有用的技

6、術(shù)檢測(cè)手段。
　　 通過對(duì)Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)和對(duì)照菌株Cry-B(1Ac)裂解前的菌體全蛋白做無標(biāo)記定量的shot-gun質(zhì)譜鑒定和蛋白表達(dá)差異分析，初步探索了可能參與影響殺蟲蛋白晶體形成的調(diào)控因子。從Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)菌株和Cry-B(1Ac)菌株中分別鑒定到201和138個(gè)非冗余蛋白，其中114個(gè)為兩菌株共同所有。蛋白功能分類發(fā)現(xiàn)兩個(gè)菌株中功能歸于氧化還原類(Oxidation-r

7、eduction)的蛋白數(shù)量所占比例差異很大，說明菌體內(nèi)的氧化還原環(huán)境可能是造成晶體形成差異較大的原因之一。通過蛋白表達(dá)差異比較分析，找到了兩菌株中豐度差異較大的共有蛋白和豐度較大的獨(dú)有蛋白，如共同作用參與蛋白折疊與組裝的60kDa伴侶蛋白((GroEL)和10kDa伴侶蛋白(GroES)、參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的CIp類蛋白酶和催化還原過氧化氫的過氧化氫酶等，均有可能是參與Bt殺蟲蛋白晶體形成的調(diào)控因子。例如同源性較高的GroEL，已經(jīng)有研