29676.藍藻藻藍蛋白的生物合成及裂合酶催化功能的研究

1、華中科技大學博士學位論文藍藻藻藍蛋白的生物合成及裂合酶催化功能的研究姓名：張娟申請學位級別：博士專業(yè)：環(huán)境科學指導教師：趙開弘20091001II華中科技大學博士學位論文華中科技大學博士學位論文結合。加入與CpeT1和CpeS1同源的裂合酶輔助催化時，生成產(chǎn)物也為非天然產(chǎn)物，不能得到CpcB的天然色素蛋白。此外，在已有的體外重組條件下，摸索了pH值、二價金屬離子以及還原劑ME對CpeT1體外催化活性的影響，結果顯示，pH6.5~7.0時

2、裂合酶催化活性最好，二價金屬離子的加入并不能促進酶反應活性，大多數(shù)反而抑制反應，去污劑和甘油的加入也會降低酶的生物活性。因此，CpeT1體外催化最佳反應條件為500mmolLKPB150mmolLNaClpH7.2，不需加入其他輔助因子。在最佳重組體系中，裂合酶CpeT1催化CpcB得到色素蛋白的光譜圖與體內重組產(chǎn)物相同，多酶的協(xié)助催化仍然不能生成天然產(chǎn)物。以上重組生成的色素蛋白經(jīng)圓二色譜檢測，結果顯示各色素蛋白在可見光區(qū)的構象均與天然

3、色素蛋白相同，在紫外光區(qū)呈現(xiàn)天然藻膽蛋白的α螺旋結構。裂合酶CpeT1經(jīng)特異性的化學劑修飾后，可以確定其功能氨基酸。修飾劑12環(huán)己二酮專一性修飾精氨酸，焦碳酸二乙酯修飾組氨酸，磷酸吡哆醛修飾賴氨酸，碳化二亞胺修飾羧基氨基酸。化學修飾結果表明，精氨酸和組氨酸被修飾后活性降低，熒光和紫外吸收特征峰值發(fā)生改變；賴氨酸和羧基氨基酸被修飾后，重組產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相近，沒有發(fā)生變化。證明精氨酸和組氨酸可能是與裂合酶活性相關的氨基酸。同時，通過體內重組

4、與體外重組的方法，判斷裂合酶His6CpeT1能否與藻藍色素PCB連接。體內重組產(chǎn)物紫外吸收峰值為620nm左右，經(jīng)酸性尿素變性后變?yōu)?94nm，證明產(chǎn)物為游離色素，CpeT1在大腸桿菌體內不連接色素PCB。體外重組產(chǎn)物紫外吸收峰值在619nm左右，變性洗脫后基本無色素產(chǎn)物，進一步證明裂合酶CpeT1不能連接藻藍色素PCB，其酶催化機理將進一步深入研究。CpeS1具有廣泛的催化活性，是藻藍蛋白中比較重要的裂合酶。經(jīng)過化學修飾發(fā)現(xiàn)，半胱氨

5、酸和精氨酸等氨基酸能影響CpeS1的生物活性。使用定點突變試劑盒將CpeS1的51位和63位半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸，將18位、147位、169位分別突變?yōu)槔i氨酸、谷胺酰胺和亮氨酸。通過同源性比對，此五個氨基酸在同源的十余個蛋白中具有較高的同源性。同時，使用蛋白質二級結構分析軟件分析定點突變后蛋白質結構變化情況。分析結果發(fā)現(xiàn)，51位和147位氨基酸的突變導致了蛋白質二級結構的改變，而其余幾位定點突變后的結構變化微小。在大腸桿菌體內表達出帶有