Calpain-2核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡.pdf

1、【引言】
　　長期慢性高血壓可引起心肌肥厚，早期呈代償性心肌收縮力增強，隨著心室的重構(gòu)，心肌肥厚就會向心衰轉(zhuǎn)化。心肌細(xì)胞的凋亡在其中扮演著重要角色，甚至在代償性心肌肥厚早期，肥大的心肌細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的作用下凋亡率就會增高，即肥大的心肌細(xì)胞凋亡易感性升高，但是其具體機制尚不清楚。探討肥大心肌細(xì)胞凋亡易感性增加的機制可為預(yù)防心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。研究證實心肌細(xì)胞在肥大的過程中鈣依賴性蛋白酶（calpain）活

2、性增加，促進肌節(jié)蛋白的更新；同時鈣/鈣調(diào)蛋白激酶ⅡδB活性增高，促進肌節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄與合成，二者共同作用促進心肌細(xì)胞的肥厚。我們在實驗中觀察到在肥大的心肌細(xì)胞中calpain-2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，可能參與調(diào)節(jié)肥大心肌細(xì)胞的凋亡。因此，本實驗利用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型來模擬高血壓性心肌肥厚，比較了肥大心肌細(xì)胞與正常大鼠心肌細(xì)胞的異同點，認(rèn)為calpain-2被激活核轉(zhuǎn)位降解CaMKⅡδB可能是肥大心肌細(xì)胞凋亡易感性增加的分子機制之一。

3、>　　【目的】
　　1、制作腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型（TAC）并觀察心肌肥厚情況。
　　2、觀察AngⅡ?qū)ON組和TAC組心肌細(xì)胞凋亡率的影響。
　　3、觀察CON組與TAC組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　4、觀察CON組與TAC組心肌細(xì)胞內(nèi)calpain-2定位、活性的變化。
　　5、觀察CON組與TAC組心肌細(xì)胞核內(nèi)CaMKⅡδB的變化。
　　6、觀察CON組與TAC組心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-

4、2的表達(dá)變化情況以及線粒體膜電位和細(xì)胞色素c的釋放情況。
　　【方法】
　　本實驗采用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型模擬長期慢性后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌肥厚，用心臟B超觀察心肌肥厚程度和心功能的變化，原位凋亡檢測心肌細(xì)胞凋亡率，用鈣熒光探針Fluo3/AM標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察Ca2+濃度的變化，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和WesternBlot技術(shù)檢測calpains、CaMKⅡδB、Cytoc等蛋白質(zhì)的定位和表

5、達(dá)情況。用免疫共沉淀技術(shù)檢測calpain-2和CaMKⅡδB之間的相互關(guān)系。用Real-TimePCR檢測左心室心肌中Bcl-2mRNA的表達(dá)水平。用線粒體膜電位熒光探針JC-1結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化。細(xì)胞免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察Cytoc的分布形式來反映Cytoc的釋放情況，線粒體內(nèi)的Cytoc呈規(guī)則的顆粒狀分布。
　　【結(jié)果】
　　1、腹主動脈縮窄16w大鼠心肌出現(xiàn)肥厚，凋亡易感性明顯增

6、加
　　采用心臟B超觀察模型組心肌肥厚程度，顯示腹主動脈縮窄16w后心臟室間隔和后壁明顯肥厚，短軸縮短率（FS）增大，射血分?jǐn)?shù)（EF）升高，心臟呈現(xiàn)代償性肥厚。TUNEL法原位檢測心肌細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)TAC組心肌細(xì)胞凋亡率并未明顯高于CON組；經(jīng)AngⅡ作用后，TAC組凋亡率則明顯高于CON組；鈣蛋白酶（calpain）抑制劑PD150606則能明顯抑制AngⅡ的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　2、肥大心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高

7、　　Fluo3/AM熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，在電場刺激心肌細(xì)胞收縮的同時，用激光共聚焦顯微鏡掃描記錄鈣瞬變時Fluo3熒光強度的變化。在CON組中，核內(nèi)與胞漿內(nèi)的Ca2+濃度無明顯差異，AngⅡ可明顯提高CON組中細(xì)胞核內(nèi)的Ca2+濃度；在TAC組中，細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)Ca2+濃度都明顯高于CON組，AngⅡ使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度進一步升高。
　　3、肥大心肌細(xì)胞中calpain-2活性升高，向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位明顯
　　心肌

8、細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察calpains在心肌細(xì)胞亞細(xì)胞的分布和定位情況。Calpain-1和calpastatin主要分布于細(xì)胞漿。Calpain-2除分布于胞漿外，在核膜周圍或核內(nèi)有少量分布，AngⅡ作用后，核內(nèi)分布有增多的趨勢，在TAC組中，核轉(zhuǎn)位的calpain-2明顯增多。將細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白分離出來，用Westernblot技術(shù)檢測各組分中calpains的變化，發(fā)現(xiàn)calpain-1和calpasta

9、tin主要分布于細(xì)胞漿組分，但是calpain-2在AngⅡ作用的TAC組心肌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯增多，不但calpain-2的整體活性增強，而且核內(nèi)calpain-2大部分是被激活的，因為核內(nèi)沒有calpastatin的抑制作用，calpain-2的活性比胞漿內(nèi)更高。
　　4、核轉(zhuǎn)位的calpain-2激活后降解CaMKⅡδB
　　用Westernblot技術(shù)檢測細(xì)胞核內(nèi)的CaMKⅡδB的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著核內(nèi)calpain-

10、2的增多和活性的增強，CaMKⅡδB的表達(dá)減少。免疫共沉淀實驗證實TAC組經(jīng)AngⅡ作用后，細(xì)胞核內(nèi)的calpain-2與CaMKⅡδB的相互作用增加，提示CaMKⅡδB可能是激活的calpain-2的底物蛋白，calpain-2調(diào)節(jié)CaMKⅡδB的表達(dá)。
　　5、Bcl-2表達(dá)減少，線粒體凋亡通路容易被激活
　　Real-TimePCR檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制因子Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄情況，證實TAC組大鼠心臟在AngⅡ的作用下B

11、cl-2的mRNA表達(dá)水平明顯減少；WesternBlot結(jié)果顯示TAC組Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯減少，在AngⅡ的刺激下Bcl-2的表達(dá)進一步降低。同時觀察到，在該組中，線粒體膜電位明顯降低，CytoC向胞漿內(nèi)的釋放增多，線粒體凋亡通路被激活。
　　【結(jié)論】
　　本研究利用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型模擬長期后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌肥厚，在腹主動脈縮窄16w后，心臟室間隔和后壁明顯肥厚，左心室內(nèi)徑縮小，心肌收縮功能增強。肥大的心

12、肌細(xì)胞中，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的Ca2+濃度增加，calpain-2的活性增加，并且向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位；在AngⅡ刺激作用下，核內(nèi)的Ca2+濃度進一步升高，calpain-2活性增強，且沒有calpastatin的抑制，活化的calpain-2降解CaMKⅡδB，引起凋亡抑制因子Bcl-2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)減少，細(xì)胞抗凋亡的能力降低，從而使線粒體凋亡通路容易被激活，導(dǎo)致肥大心肌細(xì)胞凋亡易感性增加。本研究初步闡述了calpain-2核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋