半滑舌鰨(Cynoglossu semilaevis)兩種抗菌肽和細胞因子Midkine的克隆與表達分析.pdf

1、本研究以實驗室已構(gòu)建的半滑舌鰨cDNA文庫為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)、染色體步移等技術(shù)篩選出半滑舌鰨兩種抗菌肽hepcidin、NK-lysin以及一種細胞因子Midkine基因全長，并通過研究這三個基因的序列，基因結(jié)構(gòu)，正常組織、發(fā)育時期和免疫刺激下的表達情況，體外表達及活性檢測等方面，為進一步研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)將主要研究結(jié)果分述如下：
　　 半滑舌鰨CsHepcidin cDNA序列由171 bp5’-UTR，291 bp OR

2、F和151 bp3’-UTR組成，預(yù)計編碼96個氨基酸殘基的前體，該前體由信號肽，前體肽和成熟肽組成，成熟肽具有保守的8個半胱氨酸殘基。hepcidin基因全長由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，內(nèi)含子2存在一個三堿基ACA重復(fù)的微衛(wèi)星。序列、基因組結(jié)構(gòu)和進化分析均表明CsHepcidin是魚類hepcidin1家族成員。熒光定量PCR顯示CsHepcidin在各組織中均有不同程度的表達，其中在肝臟和腦中表達量較高，而在胚胎和仔魚發(fā)育過程中，

3、孵化后6 d CsHepcidin顯著增加，而在變態(tài)期則明顯降低，暗示CsHepcidin的表達受半滑舌鰨胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)，并可能參與半滑舌鰨變態(tài)期發(fā)生的復(fù)雜的生理生化過程。鰻弧菌免疫刺激后，CsHepcidin在肝臟、脾臟和頭腎中的表達都有顯著增加，表明CsHepcidin可能在半滑舌鰨對外界刺激和病原生物侵襲的防御過程中有不可忽視的作用。為研究CsHepcidin的抗菌活性，本研究成功構(gòu)建了原核表達載體pET32a(+)-HEP，并轉(zhuǎn)

4、化進宿主菌BL21(DE3)pLysS，成功誘導(dǎo)表達可溶性的重組蛋白HEP，純化的重組蛋白對多種菌株的生長都有不同程度的抑制作用，尤其是對海洋致病菌鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌等效果比較明顯，而對革蘭氏陽性菌株金黃色葡萄球菌的抗菌能力則較弱。
　　 半滑舌鰨抗菌肽NK-lysin基因全長1516 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，其cDNA序列全長683 bp，包括5’-UTR47 bp，ORF408 bp和3’-UTR228 bp

5、，預(yù)計編碼135個氨基酸殘基組成的分泌性蛋白，成熟肽具有6個保守的半胱氨酸殘基以及一個SAPLIP家族典型特征的Saposin B結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明CsNK-lysin與牙鲆、大西洋鮭的一致性較高，而與牛、馬、豬和雞的NK-lysin則很低。CsNK-lysin保守的蛋白結(jié)構(gòu)、序列特征和相似的三級結(jié)構(gòu)暗示CsNK-lysin可與入侵病原菌相互作用，并顯示抗菌活性。本研究中發(fā)現(xiàn)由于內(nèi)含子4的不正常剪切，半滑舌鰨中CsNK-lysin存

6、在三種剪切型，三者的C端序列存在幾個氨基酸殘基的差異。熒光定量PCR顯示CsNK-lysin三種剪切型的組織表達具有一定相似性，均在小腸和心臟中表達水平較高。鰻弧菌免疫刺激后，CsNK-lysin三種剪切型在小腸、脾臟和頭腎中的表達呈現(xiàn)不同模式，表明CsNK-lysin可能參與半滑舌鰨的非特異性免疫過程，但具體的調(diào)控機理尚不明確。
　　 半滑舌鰨細胞因子Midkine基因全長3541 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。CsMi

7、dkine cDNA序列全長1098 bp，包括5’-UTR159 bp，3’-UTR504 bp以及ORF435bp，預(yù)計編碼144個氨基酸殘基組成的分泌性蛋白，成熟肽富含半胱氨酸和堿性氨基酸，具有典型的Pleiotrophin/Midkine家族的結(jié)構(gòu)特征。CsMidkine基因的5’側(cè)翼鄰接甘油二酯激酶基因，并存在視黃酸受體結(jié)合位點、類固醇/甲狀腺激素受體結(jié)合位點、Sp1、GATA-1、Mef，C/EBP等多種潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位

8、點。熒光定量PCR顯示CsMidkine在成魚腦組織中特異性表達，而在半滑舌鰨胚胎發(fā)育過程中，CsMidkine表達量在原腸胚中期開始顯著增加，在神經(jīng)胚和腦部分化時期其表達都有顯著變化。整體原位雜交顯示CsMidkine主要集中在胚胎頭部表達，在未來的間腦、中后腦邊界(MHB)和后腦一直存在高強度的雜交信號，個別區(qū)域信號變化，如神經(jīng)管。從表達時間、表達分布結(jié)合系統(tǒng)進化樹綜合分析，推測半滑舌鰨CsMidkine屬于MKb分支，參與半滑舌鰨