Il-18與Il-2協(xié)同誘導(dǎo)人外周血NK細(xì)胞殺傷功能和NKG2D表達(dá)的研究.pdf

1、目的：自然殺傷(Natural killer，NK)細(xì)胞是機(jī)體主要的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，可清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞并抵御病毒、細(xì)菌等的入侵，發(fā)揮天然免疫監(jiān)視功能。腫瘤患者體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量及活性降低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素。通過(guò)激活內(nèi)源性NK細(xì)胞或?qū)Ⅲw外活化的NK細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性轉(zhuǎn)移，有望增強(qiáng)癌癥患者機(jī)體免疫能力，對(duì)改善臨床預(yù)后和提高存活率具有重要意義。NK細(xì)胞活性受大量細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。白細(xì)胞介素-18(Interleukin

2、-18，IL-18)是一種多功能細(xì)胞因子，強(qiáng)烈誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFN-γ并促進(jìn)NK細(xì)胞的活化，從而影響NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。當(dāng)IL-18聯(lián)合其他細(xì)胞因子如IL-12或IL-15體外刺激NK細(xì)胞時(shí)，對(duì)NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性以及INF-γ分泌能力呈現(xiàn)更為顯著的增強(qiáng)效應(yīng)。白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）曾被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤免疫治療，然而大劑量IL-2使用所引起的嚴(yán)重并發(fā)癥極大地限制了其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值。目前

3、，國(guó)際上研究熱點(diǎn)是將IL-2與其他細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，以降低IL-2的不良反應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，將重組人IL-18應(yīng)用于進(jìn)展期癌癥患者時(shí)，與其他細(xì)胞因子相比，IL-18具有極少的毒副作用，且其發(fā)揮生物學(xué)活性的安全劑量范圍更廣。IL-18與IL-2聯(lián)合應(yīng)用有望成為增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的有效策略，但目前IL-18聯(lián)合IL-2對(duì)NK細(xì)胞的具體調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制尚不明確。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在觀察IL-18和IL-2聯(lián)合誘導(dǎo)的人外周血NK細(xì)胞對(duì)腫瘤

4、細(xì)胞的殺傷活性及其表面活化性受體NKG2D表達(dá)情況，探究IL-18和IL-2對(duì)NK細(xì)胞的協(xié)同誘導(dǎo)活化作用，并初步分析其調(diào)節(jié)機(jī)制，為腫瘤免疫治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從肝素抗凝的人外周靜脈全血中無(wú)菌分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。不同濃度的重組人IL-18(0，100，200 ng/ml)和重組人IL-

5、2(0，100，200 U/ml)體外聯(lián)合誘導(dǎo)新鮮分離的人PBMCs48 h，實(shí)驗(yàn)分為IL-18和IL-2聯(lián)合處理組、IL-18單獨(dú)處理組、IL-2單獨(dú)處理組以及對(duì)照組（未經(jīng)細(xì)胞因子處理）。三色熒光-流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)CD107a陽(yáng)性NK細(xì)胞比率以評(píng)估NK細(xì)胞對(duì)人白血病細(xì)胞K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的殺傷活性。同樣方法檢測(cè)活化性受體NKG2D在NK細(xì)胞表面的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：1.IL-18和IL-2聯(lián)合誘導(dǎo)新鮮分離的

6、人PBMCs48 h后，CD107a陽(yáng)性NK細(xì)胞比率顯著升高，明顯高于IL-18或IL-2單獨(dú)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞K562和HT29的殺傷活性顯著增強(qiáng)。
　　2.不同的細(xì)胞因子刺激后，各實(shí)驗(yàn)組CD3-CD56+ NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞群的百分比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，提示IL-18與IL-2聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人NK細(xì)胞的增殖無(wú)明顯促進(jìn)作用。
　　3.新鮮分離的人PBMCs經(jīng)IL-18（2

7、00 ng/ml）和IL-2(100 U/ml)刺激48 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與單一應(yīng)用IL-18或IL-2相比，IL-18和IL-2聯(lián)合處理組NK細(xì)胞表面NKG2D受體表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.細(xì)胞因子刺激過(guò)的人PBMCs經(jīng)抗NKG2D中和抗體處理1h以阻斷NKG2D介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，IL-18聯(lián)合IL-2對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的上調(diào)作用被大大削弱，提示IL-18和IL-2對(duì)NK細(xì)胞毒活