天冬酰胺合成酶B體外篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、天冬酰胺合成酶B（AS-B）是一個(gè)廣泛存在于植物和微生物體內(nèi)催化天冬酰胺合成的關(guān)鍵性酶，已經(jīng)證實(shí)為除草劑環(huán)庚草醚的靶標(biāo)酶。本研究構(gòu)建了AS-B的原核表達(dá)載體，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了AS-B，并對(duì)其進(jìn)行了純化及活性測(cè)定。使用已知除草劑環(huán)庚草醚及1, 4-桉樹腦對(duì)所構(gòu)建的篩選模型進(jìn)行了驗(yàn)證，并應(yīng)用此模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的四株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行篩選。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1) 將本研究克隆得到的大豆AS-B基因按正確閱讀框

2、克隆到原核表達(dá)載體pET30a (+)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3) pLysS，對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了摸索，獲得蛋白的最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明，當(dāng)IPTG終濃度為0.5 mM，于16 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)14 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，約60％的目的蛋白以可溶性形式存在。
　　 （2）將獲得的可溶性AS-B在4 ℃條件下用鎳柱純化去除雜蛋白，再經(jīng)LH-20葡聚糖凝膠柱脫鹽，最終可獲得純度大于90％的AS-B。使用高效液

3、相色譜法對(duì)酶活性進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)以Gln和NH4Cl為氮源時(shí)，測(cè)得酶比活值分別為2.32 μmol/min﹒mg與2.6 μmol/min﹒mg。
　　 （3）用已知靶標(biāo)除草劑環(huán)庚草醚和化合物1, 4-桉樹腦對(duì)此篩選模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明1, 4-桉樹腦可以抑制AS-B的活性，其I50 值為0.03 μg/mL，而環(huán)庚草醚對(duì)AS-B活性沒(méi)有明顯抑制，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明已成功構(gòu)建AS-B體外篩選模型。
　　 (4) 應(yīng)用此