天冬酰胺合成酶在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與預(yù)后分析及功能研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第五位，死亡率位于第三位。HCC也是我國(guó)常見高發(fā)腫瘤之一，每年新增患者占全世界新增患者的一半，且發(fā)病率逐年上升。HCC高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移、對(duì)化療敏感性低、預(yù)后差，是全球最常見的致死性惡性腫瘤之一。HCC同乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒以及黃曲霉毒素污染等因素相關(guān)，其發(fā)生與發(fā)展是由體內(nèi)多種基因參與的，多種步驟協(xié)

2、同作用的一個(gè)復(fù)雜過程。
　　 手術(shù)切除、肝臟移植、局部消融以及經(jīng)皮肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)是目前HCC的常用治療方法，其中，外科根治性切除是目前HCC首選治療方法之一，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，并成為死亡的主要原因。手術(shù)切除及肝移植是目前治療HCC最為有效的方法，但是HCC患者在患病早期癥狀并不明顯，并且缺少特異性高的腫瘤標(biāo)志物以及供肝缺乏等原因，只有少數(shù)病人能夠獲得手術(shù)切除或者肝移植的機(jī)會(huì)，加之HCC具有高度惡性的生物學(xué)行為，手術(shù)后

3、容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移，從而影響患者生存率，在全世界范圍內(nèi)，HCC的5年生存率僅有3％-5％，HCC術(shù)后5年生存率也僅有30％-40％。此外，對(duì)化療藥物的不敏感，也是HCC患者生存率低的一個(gè)原因。目前臨床上常用的TNM分期和BCLC分期，是HCC預(yù)后的重要參考指標(biāo)，但傳統(tǒng)的臨床分期來預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后是有缺陷的，HCC的預(yù)后，與其自身分子生物學(xué)行為密切相關(guān)。此外，傳統(tǒng)的HCC病理學(xué)診斷、分型以及分類方法也存在局限性，無法從分子水平上體現(xiàn)

4、肝癌的生物學(xué)行為，無法充分反映HCC的真實(shí)本質(zhì)，更無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)HCC的分子生物學(xué)行為。因此，尋找能夠反映HCC分子生物學(xué)特征的標(biāo)志，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，是目前肝癌研究的重要方向。
　　 天冬酰胺合成酶(ASNS)主要定位于胞漿中，依賴ATP催化天冬氨酸與谷氨酰胺生成天冬酰胺與谷氨酸。ASNS在倉(cāng)鼠的ts11細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞通過G1期從而完成細(xì)胞周期的作用;ASNS過表達(dá)可以減輕胰腺癌細(xì)胞因?yàn)槠咸烟莿儕Z或者順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋

5、亡，提示其在胰腺癌細(xì)胞中可能起到抗凋亡的作用;ASNS在急性淋巴細(xì)胞白血病以及部分急性髓性細(xì)胞白血病對(duì)天冬酰胺酶治療耐藥的病人中的表達(dá)升高，故ASNS的表達(dá)強(qiáng)弱被認(rèn)為同天冬酰胺酶是否耐藥相關(guān);ASNS也可以作為在卵巢癌及胰腺癌的細(xì)胞系中天冬酰胺酶治療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志，ASNS低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)天冬酰胺酶更敏感;此外，還有研究認(rèn)為ASNS在去勢(shì)手術(shù)耐受的前列腺癌（CRPC）中高表達(dá)，利用ASNS抑制劑來耗竭天冬酰胺可能是治療CRPC病人

6、的一個(gè)新的方法策略。
　　 我們前期通過蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出ASNS在肝細(xì)胞癌腫瘤組織中特異性高表達(dá)，提示ASNS可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。目前對(duì)ASNS在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況、預(yù)后分析以及功能研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究的目的一方面研究ASNS在肝癌中的表達(dá)情況并結(jié)合臨床資料探討其表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系;另一方面研究ASNS在肝癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制;為深入了解肝細(xì)胞癌的生物學(xué)行為以及為可能的靶向治療提供理論依據(jù)。

7、
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.運(yùn)用real-time PCR、western blot以及IHC等方法檢測(cè)肝細(xì)胞癌、癌旁及正常肝組織中ASNS的表達(dá)情況;
　　 2.IHC方法檢測(cè)大鼠DEN誘癌過程中ASNS在肝臟中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過程;
　　 3.結(jié)合臨床資料統(tǒng)計(jì)分析ASNS與相關(guān)臨床指標(biāo)及預(yù)后之間的關(guān)系;
　　 4.資料收集及統(tǒng)計(jì)方法:
　　 (1)隨機(jī)選取2002-2007年在我院行肝

8、癌根治術(shù)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者標(biāo)本269例，制作組織芯片，并收集完善病史及隨訪資料;以免疫組化方法檢測(cè)組織芯片標(biāo)本中ASNS的表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析ASNS的表達(dá)與肝癌患者各項(xiàng)臨床特征（腫瘤大小、血管侵犯、肝內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）及遠(yuǎn)期生存（無瘤生存率、總生存率和生存時(shí)間等）的關(guān)系。
　　 (2)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以median(Q1-Q3)表示。x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法用來進(jìn)行定性資料的比較。組間定量分析用

9、wilcoxon配對(duì)秩檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用spearman秩相關(guān)。累計(jì)生存和復(fù)發(fā)率的計(jì)算采用Kaplan-Meier，生存曲線用Log-rank繪制并進(jìn)行生存分析。P＜0.05視為統(tǒng)計(jì)顯著。
　　 5.構(gòu)建ASNS過表達(dá)及RNA干擾質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，western blot鑒定效果;構(gòu)建ASNS RNA干擾慢病毒并感染肝癌細(xì)胞系，獲得ASNS穩(wěn)定敲減的MHCC97H及MHCCLM3細(xì)胞株。
　　 6.CCK-8方法檢

10、測(cè)ASNS高低表達(dá)對(duì)多種肝癌細(xì)胞系增殖的影響;
　　 7.平板克隆形式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASNS高低表達(dá)細(xì)胞株的克隆形成能力;
　　 8.Transwell方法檢測(cè)ASNS高低表達(dá)細(xì)胞株的遷移及侵襲能力;
　　 9.spheroid克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASNS高低表達(dá)對(duì)細(xì)胞株的干細(xì)胞自我更新能力的影響;
　　 10.用western blot檢測(cè)在TNFα與CHX刺激下ASNS高低表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;
　　

11、11.擴(kuò)增ASNS高低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系行裸鼠皮下荷瘤，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況;
　　 12.ASNS高低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株行裸鼠尾靜脈注射，觀察肺轉(zhuǎn)移情況及裸鼠生存情況;
　　 13.CCK-8方法檢測(cè)ASNS高低表達(dá)細(xì)胞株在天冬酰胺酶處理后的增殖能力;
　　 14.裸鼠皮下荷瘤后腹腔內(nèi)注射天冬酰胺酶，觀察ASNS高低表達(dá)細(xì)胞株腫瘤生長(zhǎng)情況;
　　 15.觀察高低表達(dá)ASNS肝癌細(xì)胞對(duì)抗外界刺激能力(H2O2)的影響

12、;
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.ASNS在肝癌組織中高表達(dá):
　　 (1) ASNS在58例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于及癌旁組織樣本中，兩者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0008)。與18例正常肝組織相比，58對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌及癌旁組織樣本中ASNS的mRNA表達(dá)水平顯著增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0036，P=0.0258)。58對(duì)原發(fā)性肝癌與癌旁組織中，ASNS的mRNA表達(dá)水平，癌組

13、織中高于癌旁組織的有44對(duì)(44/58，76％)。
　　 (2) ASNS在10對(duì)肝癌及其癌旁組織樣本中的蛋白表達(dá)，7對(duì)(70％)在癌組織中表達(dá)高于癌旁組織。
　　 (3)在269例肝癌病人組織芯片標(biāo)本中，ASNS在肝癌組織中蛋白水平的表達(dá)高于癌旁組織及正常肝臟組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01);
　　 2.在大鼠DEN誘癌過程中，ASNS在肝臟中的表達(dá)逐漸升高:
　　 IHC顯示隨著

14、DEN誘癌時(shí)間延長(zhǎng)，ASNS表達(dá)逐漸升高，在晚期肝硬化期及早期肝癌期ASNS的表達(dá)水平達(dá)到最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)與腫瘤的進(jìn)展，ASNS的表達(dá)水平下降，而對(duì)照組大鼠肝臟ASNS的表達(dá)無明顯變化，始終低于DEN組。
　　 3.臨床資料統(tǒng)計(jì)分析:
　　 (1)卡方檢驗(yàn)顯示ASNS在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與血清AFP水平、腫瘤直徑、鏡下血管侵犯、腫瘤包膜完整性、BCLC分期及TNM分期負(fù)相關(guān)，與術(shù)前白蛋白水平正相關(guān);
　　

15、(2) ASNS表達(dá)與1，3，5年生存時(shí)間呈正相關(guān)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ASNS是影響肝癌患者術(shù)后總體生存率的獨(dú)立預(yù)后保護(hù)因素(Hazard ration0.744，95％CI0.565-0.979)。
　　 4.構(gòu)建了ASNS過表達(dá)及RNA干擾質(zhì)粒，構(gòu)建了ASNS的RNA干擾慢病毒并分別構(gòu)建和鑒定了MHCCLM3及MHCC97H高低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系;
　　 5.ASNS的差異表達(dá)對(duì)肝癌生物學(xué)功能的影響:
　　 (1

16、)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)ASNS抑制肝癌細(xì)胞增殖，ASNS敲減促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖;
　　 (2) ASNS敲減增強(qiáng)肝癌細(xì)胞克隆隆形成能力;
　　 (3) ASNS過表達(dá)下調(diào)CyclinD1表達(dá)并引起細(xì)胞周期阻滯于G1期;ASNS敲減促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展并上調(diào)CyclinD1表達(dá);
　　 (4)ASNS敲減促進(jìn)皮下荷瘤裸鼠的腫瘤增殖能力;
　　 (5)ASNS敲減增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移能力及侵襲能力(P＜0.01)，過表達(dá)A

17、SNS抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力(P＜0.01);
　　 (6)ASNS敲減增強(qiáng)尾靜脈注射裸鼠的肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力(P＜0.01)，增加其死亡率(P＜0.05);
　　 (7)ASNS敲減抑制肝癌細(xì)胞的凋亡;
　　 (8)ASNS敲減可減輕肝癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激;
　　 (9)ASNS敲減可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的自我更新能力(P＜0.01)。
　　 6.ASNS敲減增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)天冬酰胺酶的敏感性:
　

18、　 (1)天冬酰胺酶對(duì)ASNS低表達(dá)的SMMC7721與PLC細(xì)胞株增殖的抑制明顯強(qiáng)于ASNS高表達(dá)的MHCCLM3與MHCC97H細(xì)胞株;在天冬酰胺酶處理下，ASNS敲減的肝癌細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照細(xì)胞株(P＜0.01);
　　 (2)皮下注射ASNS敲減肝癌細(xì)胞的裸鼠經(jīng)腹腔注射天冬酰胺酶，其腫瘤體積較皮下注射對(duì)照細(xì)胞組裸鼠顯著減小(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究發(fā)現(xiàn)ASNS在肝癌組織中高表達(dá)

19、，與血清AFP水平、術(shù)前白蛋白水平、腫瘤直徑、鏡下血管侵犯、腫瘤包膜完整性、BCLC分期及TNM分期密切相關(guān)。ASNS是肝癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)后因素，有望成為肝癌預(yù)后評(píng)估的一項(xiàng)有前景的指標(biāo)。進(jìn)一步體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明ASNS在肝癌發(fā)生過程中起抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及自我更新，促進(jìn)凋亡與增強(qiáng)氧化應(yīng)激的作用，其抑制增殖可能通過抑制細(xì)胞周期素CyclinD1的表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。另外，ASNS的表達(dá)與天冬酰胺酶處理的敏感性有關(guān)，