免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)流感病毒的研究.pdf

1、目的：
　　制備偶聯(lián)甲/乙型流感病毒單克隆抗體的免疫磁珠，利用免疫磁珠可以分離、富集、濃縮病原微生物的特征，并結(jié)合免疫層析技術(shù)，建立甲/乙型流感病毒的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1.通過(guò)膠體金標(biāo)記和免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法，初步建立快速檢測(cè)甲/乙型流感病毒的膠體金免疫層析方法，評(píng)價(jià)其靈敏度和特異性。
　　2.以納米磁珠代替膠體金作為標(biāo)記物的信號(hào)指示載體，采用雙抗體夾心檢測(cè)方法，以

2、EDC/NHS法制備偶聯(lián)了甲/乙型流感病毒抗體的免疫磁珠。
　　3.優(yōu)化免疫層析檢測(cè)系統(tǒng)，確定檢測(cè)線和質(zhì)控線的抗體最佳包被濃度和優(yōu)化緩沖液的表面活性劑。利用免疫磁珠結(jié)合免疫層析技術(shù)，初步建立磁珠免疫層析直接檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)其靈敏度。
　　4.利用免疫磁珠將目標(biāo)抗原濃縮及富集分離的特性，優(yōu)化檢測(cè)條件，建立快速檢測(cè)甲/乙型流感病毒的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)方法。
　　5.將梯度稀釋的甲/乙型病毒液，進(jìn)行熒光定量PCR

3、(Real-Time PCR)檢測(cè)，檢測(cè)的CT值越低，病毒的起始濃度越高。根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)磁珠免疫層析法、免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)法以及膠體金免疫層析法的靈敏度。
　　6.采用熒光定量PCR方法檢測(cè)甲/乙型流感作為標(biāo)準(zhǔn)，免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)法檢測(cè)80份臨床咽拭子樣本，同時(shí)與用傳統(tǒng)的膠體金檢測(cè)法進(jìn)行比較，評(píng)估磁珠富集檢測(cè)與免疫層析一體化檢測(cè)方法的靈敏度、特異性及陽(yáng)性符合率，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　

4、　結(jié)果：
　　1.初步建立了甲/乙型流感病毒檢測(cè)的膠體金免疫層析法，其靈敏度較高，特異性較好。
　　2.優(yōu)化免疫層析系統(tǒng)，甲型流感病毒膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)線抗體包被濃度為2mg/mL，質(zhì)控線抗體濃度為300ng/mL;乙型流感病毒膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)線抗體包被濃度為4mg/mL，質(zhì)控線抗體濃度為300ng/mL，檢測(cè)效果最佳。納米磁珠免疫層析直接檢測(cè)方法可以檢出稀釋度為10-2的（相應(yīng)的熒光定量PCR檢測(cè)Ct值為20）甲型H

5、1N1流感病毒，可以檢出稀釋度為10-1的乙型流感病毒（相應(yīng)的熒光定量PCR檢測(cè)Ct值為23）。
　　3.通過(guò)磁珠將樣本富集、濃縮、分離后，建立的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)法可以檢出甲型H1N1流感病毒稀釋度為10-3，乙型流感病毒稀釋度為10-2，說(shuō)明本法與納米磁珠免疫層析直接檢測(cè)方法相比，靈敏度得到了明顯提高，并且檢測(cè)其他呼吸道病毒為陰性，說(shuō)明特異性好。
　　4.納米磁珠免疫層析直接檢測(cè)方法與膠體金免疫層析檢測(cè)方法

6、在特異性、靈敏度上大致相同，均可以檢出熒光定量PCR檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的Ct值≤22的咽拭子樣本，檢測(cè)乙型流感病毒的Ct值≤23的咽拭子樣本;但是免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)法可以檢出熒光定量PCR檢測(cè)甲型H1N1流感病毒Ct值≤28的咽拭子樣本，可以檢出乙型流感病毒的Ct值≤29的咽拭子樣本，說(shuō)明免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)法的檢測(cè)靈敏度比上述兩種方法提高了一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　5.免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測(cè)

7、法檢測(cè)臨床咽拭子樣本，以熒光定量PCR檢測(cè)方法作為標(biāo)準(zhǔn)，其陰性符合率（特異性）為100％，陽(yáng)性符合率為70.8％，而膠體金法檢測(cè)陰性符合率（特異性）為100％，陽(yáng)性符合率為47.9％，并且磁珠免疫層析法與膠體金法之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　采用EDC/NHS方法制備了偶聯(lián)甲/乙型流感病毒單克隆抗體的免疫磁珠，探索研究了檢測(cè)甲/乙型流感病毒抗原的納米磁珠免疫層析直接檢測(cè)方法。利用磁珠的分離、富集特性