抑制TAB182基因表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性及阿司匹林療效的影響.pdf

1、肝癌在我國已成為我國惡性腫瘤致死病因的第2位。肝癌早期癥狀不明顯，病情進(jìn)展快，50.5％的新發(fā)肝癌患者出現(xiàn)在中國。目前肝癌的治療主要包括外科手術(shù)切除腫瘤、放療、化療、介入治療、射頻消融治療等，但效果不盡人意，因此預(yù)防肝癌的發(fā)生及改善預(yù)后是目前肝癌研究的熱點(diǎn)。隨著放療技術(shù)的進(jìn)展，放療能夠殺死肝癌細(xì)胞的同時也會造成周圍組織的損傷，我們?nèi)孕枰谔岣叻暖熋舾行苑矫孀龈顚哟蔚难芯?。TAB182又稱TNKS1BP1，是通過酵母雜交實(shí)驗(yàn)研究Tank

2、yrase1時被第一次發(fā)現(xiàn)，一種參與DNA損傷后修復(fù)的蛋白，能夠與能夠和DNA-Pkcs相互作用，還可以影響DNA-Pkcs磷酸化，進(jìn)一步參與DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究TAB182可以增加幅射的敏感性，并且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能，但在肝癌細(xì)胞中還沒有深入的研究。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于心血管疾病中，阿司匹林在預(yù)防胃癌、食管癌的發(fā)生已經(jīng)被證實(shí)，阿司匹林在抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡等方面也有廣泛研究

3、，但阿司匹林對于TAB182沉默的肝癌細(xì)胞的影響目前還沒有相關(guān)研究。我們通過阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞可進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，為放療及藥物治療肝癌提供新的基因靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以離體的肝癌細(xì)胞為研究對象，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆技術(shù)建立TAB182沉默的HepG2細(xì)胞模型，研究γ-射線和阿司匹林對TAB182沉默的HepG2細(xì)胞的影響。
　　方法：
　　通過CC

4、K-8、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，研究γ-射線照射后HepG2細(xì)胞增殖率和存活率的變化，并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測照射后 HepG2細(xì)胞周期的變化。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞后增殖能力的變化，流式細(xì)胞學(xué)檢測阿司匹林對 TAB182沉默的HepG2細(xì)胞周期及凋亡的改變。應(yīng)用Western blot檢測照射及阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.抑制

5、TAB182基因表達(dá)可增加肝癌HepG2輻射敏感性
　　1.1.成功建立的TAB182沉默的HepG2細(xì)胞系：與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的HepG2-NC細(xì)胞對比，TAB182蛋白在HepG2-sh-TAB182細(xì)胞中表達(dá)降低，說明TAB182沉默的細(xì)胞系建立成功。
　　1.2.沉默TAB182基因能增加輻射對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用：分別于0、2、4、6、8Gy的γ-射線照射24h后收集 HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及H

6、epG2-NC細(xì)胞，采用CCK-8方法檢測細(xì)胞的增殖能力，2Gyγ-射線照射下，HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及 HepG2-NC細(xì)胞與未照射細(xì)胞相比，增殖率沒有明顯變化（P>0.05）。與未照射HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC細(xì)胞相比，在4、6、8Gyγ-射線照射后，HepG2-sh-TAB182細(xì)胞較未照HepG2-sh-TAB182細(xì)胞增殖率明顯降低（P<0.05），而HepG2-NC細(xì)胞在8Gyγ-射線照射后

7、才出現(xiàn)增殖率的降低（P<0.05）；在同一劑量下， HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞相比增殖率下降（P<0.05），說明沉默TAB182基因能增加輻射對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　1.3.沉默TAB182基因能增加輻射對HepG2細(xì)胞生存率的抑制作用：采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測0、1、2、4、8Gyγ-射線照射下HepG2細(xì)胞生存率的變化。在1Gyγ-射線照射后， HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與

8、未照射HepG2-sh-TAB182細(xì)胞相比生存率明顯降低（P<0.01），而HepG2-NC細(xì)胞與未照射的HepG2-NC細(xì)胞相比生存率沒有明顯變化（P>0.05），在2、4、8Gyγ-射線照射后，HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞與各自未照射細(xì)胞比較生存率均出現(xiàn)明顯的降低（P<0.01）。在同一劑量下， HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞相比生存率降低（P<0.05），說明沉默TAB182

9、基因表達(dá)能增加輻射對HepG2細(xì)胞生存率的抑制作用。
　　1.4.沉默 TAB182能延長 HepG2細(xì)胞幅射后 G2／M期的周期阻滯：γ-射線照射后HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞均出現(xiàn)G2／M期阻滯，但在照射后24小時，HepG2-sh-TAB182細(xì)胞在G2／M期的周期阻滯依然存在，而HepG2-NC細(xì)胞的G2／M期的周期阻滯已經(jīng)解除，說明沉默TAB182能延長HepG2細(xì)胞幅射后G2／M期的周期阻滯

10、，抑制細(xì)胞分裂，此可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。
　　2.抑制TAB182基因表達(dá)可提高阿司匹林對HepG2細(xì)胞的療效
　　2.1.沉默TAB182基因能增加阿司匹林對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用：分別應(yīng)用0、0.5、1、2、4、8、16mmol/l阿司匹林作用24小時收集HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及 HepG2-NC細(xì)胞，隨著阿司匹林濃度的增加，對兩種細(xì)胞增殖抑制率也逐漸增高，在相同濃度下， HepG2-sh-TAB182細(xì)

11、胞比HepG2-NC細(xì)胞增殖抑制率要高（P<0.05），說明沉默TAB182基因能增加阿司匹林對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用。
　　2.2.沉默 TAB182能延長 HepG2細(xì)胞幅射后 G2／M期的周期阻滯：將8mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HepG2-sh-TAB182細(xì)胞在4h即有明顯得G2／M期周期阻滯（P<0.01），而HepG2-NC細(xì)胞在4h時未發(fā)現(xiàn)G2／M期周

12、期阻滯，在12h及24小時時兩者均存在G2／M周期阻滯（敲低組P<0.01,對照組P<0.05），在36h， HepG2-sh-TAB182細(xì)胞仍存在周期阻滯，而 HepG2-NC細(xì)胞周期阻滯已經(jīng)解除，說明TAB182基因沉默后可延長阿司匹林作用后HepG2細(xì)胞G2／M期的周期阻滯，抑制細(xì)胞分裂。
　　2.3.沉默TAB182能增加阿司匹林對HepG2細(xì)胞凋亡：將0、1、8、16mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB1

13、82細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞，阿司匹林作用 HepG2-sh-TAB182細(xì)胞后即出現(xiàn)凋亡，隨著阿司匹林濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率也隨著升高，而HepG2-NC細(xì)胞在8、16mmo/l的阿司匹林作用下才有凋亡的增高（P<0.05），相同濃度下的HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與 HepG2-NC細(xì)胞相比較， HepG2-sh-TAB182細(xì)胞的凋亡率明顯高于HepG2-NC細(xì)胞（P<0.05），說明沉默TAB182能增加阿司匹林對He

14、pG2細(xì)胞凋亡。
　　2.4.沉默TAB182能增加輻射及阿司匹林作用后HepG2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)：將4Gyγ-射線照射、16mmo/L阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白均較阿司匹林作用前表達(dá)明顯增加（P<0.05），輻射后HepG2-sh-TAB182細(xì)胞比HepG2-NC細(xì)胞cleaved-Caspase-3、