輻射損傷代謝標(biāo)志物篩選及mACON對(duì)輻射敏感性的影響研究.pdf

1、在核與輻射事故病人醫(yī)學(xué)救治處理過(guò)程中,受照劑量估算最常用的檢測(cè)手段仍然是細(xì)胞遺傳學(xué)方法——淋巴細(xì)胞染色體畸變分析。該方法雖然準(zhǔn)確,但操作較繁瑣和費(fèi)時(shí),在處理大批量傷員時(shí)有明顯的局限性。隨著國(guó)際反恐與核威脅形勢(shì)的需要,建立快速、高通量的生物劑量檢測(cè)方法用來(lái)快速篩檢批量受照傷員十分必要。應(yīng)用高通量、非侵襲性、快速的代謝組學(xué)技術(shù)尋找生物標(biāo)志物用于評(píng)估大量人群受照劑量的研究具有重要的意義。
　　本研究采用代謝組學(xué)氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC

2、/TOFMS)技術(shù)匹配主成分分析(PCA)方法,研究不同劑量γ-射線照射大鼠血清中的代謝產(chǎn)物變化,以篩選可用于輻射損傷診斷和劑量估算的生物標(biāo)志物。將SD大鼠分別給予0.75Gy、3Gy和8Gy(劑量率為1.9Gy/min)γ-射線全身照射或者假照射,受照后24小時(shí)立即收集血清樣本用于GC/TOFMS分析,多變量數(shù)據(jù)分析采用主成分分析法。結(jié)果表明,大鼠受到不同劑量γ射線照射24小時(shí)后,血清中代謝物組成產(chǎn)生了明顯不同的代謝表型,這將有助于建

3、立快速篩查受照人群的模式,以便使受照者盡早接受治療。色譜分析揭示了9種血清代謝物在照后發(fā)生了顯著改變,上升的代謝物包括肌醇、絲氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和甘油,下降的代謝物包括異檸檬酸、葡糖酸和硬脂酸。這些差異代謝產(chǎn)物有望成為新的輻射損傷標(biāo)志物,同時(shí)可以從這些差異代謝物的角度探索輻射損傷的機(jī)制,可能成為放射醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的新視角。
　　在上述研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),線粒體順烏頭酸酶(Mitochondrial Aconit

4、ase,mACON)具有調(diào)節(jié)異檸檬酸在三羧酸循環(huán)中含量的重要作用,而且mACON在耐輻射細(xì)菌基因組及骨骼肌、心肌等輻射不敏感組織中呈明顯高表達(dá),在輻射敏感組織中呈低表達(dá),為此我們?cè)O(shè)想照射后mACON的低表達(dá)和活性下降可能會(huì)影響電離輻射后細(xì)胞損傷的修復(fù),也可能是電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因。為了驗(yàn)證mACON在電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用及分子機(jī)制,我們首先構(gòu)建mACON慢病毒干涉和表達(dá)載體,并制備了干涉和表達(dá)mACON慢病毒顆粒。慢病毒干

5、涉顆粒感染HEK293、U937和HeLa三種細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后,建立起熒光穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。與空載細(xì)胞相比,干涉細(xì)胞系HEK293、U937、HeLa細(xì)胞中mACON的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)為空載細(xì)胞的16％、22%和32%,其mACON的蛋白表達(dá)水平有效減少,成功的構(gòu)建了三種干涉細(xì)胞系。同時(shí),HEK293、U937、HeLa表達(dá)細(xì)胞系中的mACON的mRNA表達(dá)水平與空載細(xì)胞相比,分別上調(diào)至2.8倍、2.0倍和12.0倍。其

6、mACON的蛋白表達(dá)水平明顯增加,表明三種表達(dá)細(xì)胞系成功。
　　隨后,選用HeLa干涉細(xì)胞系利用流式細(xì)胞方法研究mACON下調(diào)后對(duì)電離輻射誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯影響。結(jié)果表明,Hela細(xì)胞經(jīng)2Gy60Coγ射線照射后,隨時(shí)間的增加而出現(xiàn)G2/M期阻滯。HeLa-pSicoR1408細(xì)胞G2/M期比例不僅顯著低于HeLa-pSicoR細(xì)胞(P<0.01),而且其G2/M期峰值出現(xiàn)較對(duì)照細(xì)胞晚。同時(shí)利用U937表達(dá)細(xì)胞系初步研究mACON上

7、調(diào)后對(duì)電離輻射損傷后細(xì)胞早期凋亡水平的影響。當(dāng)U937細(xì)胞受到照射后24h,U937-mACON2細(xì)胞的早期凋亡水平與對(duì)U937-pBPLV細(xì)胞相比有所下降,而且在10Gy劑量水平上有顯著性差異(P<0.05)。這些結(jié)果提示mACON下調(diào)后抑制電離輻射誘發(fā)的G2/M期阻滯,細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力降低,提高細(xì)胞輻射敏感性;mACON上調(diào)后,電離輻射誘發(fā)的細(xì)胞早期凋亡比例減少,mACON初步顯示出一定的抗凋亡作用。這些研究為我們從代謝物角度