NU7441對肝癌HepG2細(xì)胞放療敏感性的影響.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer, PLC）是一種惡性程度高、治愈率低的臨床常見惡性腫瘤，居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第六位，病死率的第三位。臨床上原發(fā)性肝癌的主要治療方法包括手術(shù)治療、化療、放療、肝動脈化療栓塞、分子靶向治療、中醫(yī)治療等方法。由于肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的早期臨床癥狀不明顯，大部分患者就診時已處于肝癌晚期，失去了手術(shù)機(jī)會。隨著肝癌精確放療技術(shù)的發(fā)展，放射治療已

2、成為晚期肝癌的主要治療方法之一。放療無異于電離輻射，腫瘤細(xì)胞受到射線照射后，會發(fā)生DNA損傷，損傷如果得不到及時精確地修復(fù)，就會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞具有高效的修復(fù)機(jī)制，在受到電離輻射時，細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，繼之啟動修復(fù)機(jī)制。真核細(xì)胞DNA損傷主要存在兩種修復(fù)方式:非同源末端連接（Non homologous end joining,NHEJ）和同源重組(Homologous recombination，HR)。在電離輻射引起的DNA損

3、傷中，修復(fù)途徑以非同源末端連接為主，抑制DNA修復(fù)途徑有利于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高腫瘤放射治療的療效。DNA依賴性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)復(fù)合物是非同源末端連接修復(fù)途徑的關(guān)鍵組分，且DNA-PK的催化亞單位(DNA dependent protein kinasecatalytic subunit，DNA-PKcs)是其中的關(guān)鍵蛋白。目前多種DNA-PK抑制劑已用于腫瘤放療增敏的

4、實(shí)驗(yàn)研究，人工合成的小分子化合物NU7441作為DNA-PK的特異性抑制劑，在乳腺癌、肺癌、白血病、前列腺癌聯(lián)合放療的研究中表現(xiàn)出放射增敏效應(yīng)。NU7026是另一種DNA-PK抑制劑。有關(guān)NU7441與肝癌關(guān)系的研究目前國內(nèi)外尚乏報(bào)道，本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，擬采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)、Westernblot、免疫熒光共聚焦、單細(xì)胞凝膠電泳及流式細(xì)胞術(shù)的方法，探討NU7441對肝癌HepG

5、2細(xì)胞放療敏感性的作用及其作用機(jī)制，為臨床肝癌放療增敏劑的開發(fā)與應(yīng)用提供新思路。
　　方法:
　　1、應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測NU7441在不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L）及不同作用時間(12h、24h、48h和72h)下對HepG2細(xì)胞增殖的影響，并繪制相應(yīng)的作用曲線。
　　2、應(yīng)用Western blot的方法檢測①DNA-PKcs在正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞HepG2

6、細(xì)胞及4Gy60Coγ射線照射后的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況;②NU7441對4Gy60Coγ射線照射后的HepG2細(xì)胞中Ku70、Ku80、DNA-PKcs及pDNA-PKcs(S2056)蛋白表達(dá)的影響;③NU7441和另一種放療增敏劑NU7026在相同條件對pDNA-PKcs(S2056)蛋白表達(dá)的影響。
　　3、應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測在NU7441有無的情況下，4Gy60Coγ射線照射后的HepG2

7、細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的DNA損傷修復(fù)情況。
　　4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞在對照組(Control)、單純照射組(IR)、單純加藥組(NU7441)、加藥聯(lián)合放射組(NU7441+IR)中，作用12h后，比較各組細(xì)胞在細(xì)胞周期的各時相中所占的比例。
　　5、采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多個獨(dú)立樣本的比較采One-WayANOVA的分析方法，組間比較采

8、用SNK方法，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)表明:NU7441對HepG2細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，且具有濃度和時間依賴性;NU7441在濃度為5μmol/L及以上濃度下，這用抑制作用更加明顯（P＜0.05）。
　　2、Western blot實(shí)驗(yàn)表明:①DNA-PKcs在LO2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及4Gy60Coγ射線照射后HepG2細(xì)胞中的表達(dá)依次增高;②與未加藥照射組相

9、比，在NU7441作用下，4Gy60Coγ射線照射后HepG2細(xì)胞中Ku70、Ku80及DNA-PKcs的蛋白表達(dá)量沒有明顯變化，而磷酸化pDNA-PKcs(S2056)的蛋白表達(dá)量明顯降低，NU7441的抑制作用主要是影響了DNA-PKcs的活性;③在相同實(shí)驗(yàn)條件下，NU7441組比NU7026組pDNA-PKcs(S2056)的蛋白表達(dá)量下降明顯，NU7441對DNA-PKcs的活性抑制作用強(qiáng)于NU7026。
　　3、免疫熒光

10、實(shí)驗(yàn)表明:HepG2細(xì)胞在受照射后，細(xì)胞中的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量在一定時間范圍在先增加后減少，在加入NU7441作用以后，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量也是先增加后減少，但與單純照射組相比，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量下降的速率比照射組緩慢(P＜0.05)。
　　4、中性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明:HepG2細(xì)胞在經(jīng)過4Gy60Coγ射線處理后，DNA發(fā)生損傷，表現(xiàn)為照射組彗星細(xì)胞的尾矩明顯大于無任何處理組（P＜0.05）;經(jīng)過4h的修復(fù)后，加入NU7441

11、照射組的修復(fù)速度較單純照射組減慢，表現(xiàn)為加藥照射組的尾矩比照射組大(P＜0.05)。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)表明:與無任何處理Control組相比，IR組的G2/M期細(xì)胞的比例明顯增加(P＜0.05)，NU7441組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(NU7441+IR)組的G2/M期細(xì)胞的比例較IR組明顯增加(P＜0.05)，且細(xì)胞凋亡率與Control組相比明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:NU7441對