脂多糖通過TLR4-IκB-HMGB1通路加重幼鼠癲癇.pdf

1、背景和目的：
　　癲癇是神經(jīng)內(nèi)科最常見的疾病之一，且在兒童和青少年中發(fā)病較高，癲癇對于個(gè)人、家庭和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響。在接受規(guī)范、合理的抗癲癇藥物治療后，有20％-30%的患者仍有癲癇發(fā)作，而成為難治性癲癇。近年來大量的臨床及實(shí)驗(yàn)性研究均表明炎癥反應(yīng)和炎癥因子參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程，癲癇反復(fù)發(fā)作可引起腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織特別是海馬等癲癇敏感腦區(qū)的病理改變，炎癥反應(yīng)既是癲癇發(fā)作的結(jié)果，可能也是造成癲癇反復(fù)發(fā)作的根本原因。因

2、此探索炎癥反應(yīng)在癲癇中的機(jī)制可能為癲癇治療提供新的方向。
　　Toll樣受體4（Tolllikereceptor4，TLR4）是第一種被認(rèn)為識別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）的受體。PAMPs是由病原體產(chǎn)生的，如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）亦稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，可被TLR4識別并激活膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)。損

3、傷相關(guān)分子模式（Damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs）與PAMPs相對應(yīng)，高遷移率族蛋白（Highmobilitygroupprotein1，HMGB1）是一種核染色質(zhì)成分，正常情況下存在于細(xì)胞核中，死亡的細(xì)胞釋放的HMGB1作為一種DAMP，也可以被TLR4等模式識別受體識別引起與外源性病原體入侵類似的免疫反應(yīng)。HMGB1-TLR4信號可以活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclearfactor-κ-

4、genebinding，NF-κB）發(fā)生核轉(zhuǎn)移，而NF-κB可以上調(diào)細(xì)胞因子和其他的炎癥調(diào)節(jié)物的表達(dá)[1]。在正常生理狀況下，NF-κB與一種核因子抑制蛋白α（IkappaB-alpha，IκB-α）結(jié)合，因而以一種失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到一系列外源性刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化而失活，NF-κB與IκB發(fā)生解離，隨后遷移進(jìn)入胞核中并調(diào)節(jié)促炎性基因的轉(zhuǎn)錄[2]。然而關(guān)于癲癇患兒及幼年癲癇動物模型中HMGB1、TLR4、IκB的作用，

5、仍缺乏大量的證據(jù)支持。
　　本研究在海人酸（kainicacid，KA）誘導(dǎo)幼年大鼠癲癇發(fā)作前2h給予LPS預(yù)處理，檢測急性期海馬組織TLR4、HMGB1的基因及蛋白、IκB-α的蛋白表達(dá)水平，以及慢性期海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況，研究TLR4/IκB/HMGB1通路在癲癇發(fā)作中的作用，以及在LPS加重幼鼠癲癇發(fā)作中的作用，從而為尋找以炎癥信號通路為靶點(diǎn)的抗癲癇治療方向提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　出生21天的雄

6、性SD鼠85只隨機(jī)分為模型Ⅰ組（即KA組，n=33），用海人酸（KA）誘導(dǎo)癲癇發(fā)作；模型Ⅱ組（即L+K組，n=38），在應(yīng)用KA前2h腹腔注射LPS；生理鹽水對照組（即NS組，n=14），腹腔注射等量生理鹽水。觀察幼鼠癲癇行為學(xué)表現(xiàn)并評分，各組造模成功后存活的動物按照癲癇持續(xù)狀態(tài)（Statusepilepticus，SE）后不同時(shí)間點(diǎn)分為3h、24h、21d，平均每個(gè)亞組7只。于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，制備海馬組織勻漿液及石蠟切片標(biāo)本。熒光

7、定量PCR檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）后3h和24h各組海馬TLR4和HMGB1基因的表達(dá)，Westernblot檢測SE后3h、24h各組海馬區(qū)TLR4、HMGB1、核因子抑制蛋白α（IκB-α）蛋白的表達(dá)，免疫組化（IHC）觀察SE后21d各組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型組各時(shí)間點(diǎn)與生理鹽水組間的比較及兩模型組間比較均采用t檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為α＜0.05。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)改變

8、：模型Ⅰ組共33只SD鼠達(dá)SE并存活23只（造模成功率93.9%），造模失敗2只，死亡8只（死亡率24.2%）；模型Ⅱ組共38只SD鼠達(dá)SE并存活24只（造模成功率100%），造模失敗0只，死亡14只（死亡率36.8%）；在急性期模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠均有進(jìn)食進(jìn)水減少、激惹、攻擊性增強(qiáng)等表現(xiàn)，但模型Ⅱ組較模型Ⅰ組更加明顯。生理鹽水組14只大鼠均未死亡或發(fā)生癲癇發(fā)作。
　　2.對照組海馬區(qū)TLR4及HMGB1基因表達(dá)量均較低，SE后

9、不同時(shí)間點(diǎn)模型Ⅰ組與模型Ⅱ組海馬區(qū)TLR4及HMGB1基因表達(dá)量均比對照組顯著增加（差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05）。SE后3h模型Ⅱ組海馬區(qū)TLR4基因表達(dá)倍數(shù)比模型Ⅰ組顯著增加（差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05），SE后24h模型Ⅱ組海馬區(qū)TLR4基因表達(dá)倍數(shù)與模型Ⅰ組無顯著差異（P＞0.05），SE后3h、24h模型Ⅱ組海馬區(qū)HMGB1的表達(dá)量與模型組同時(shí)間點(diǎn)無顯著差異（P＞0.05）。
　　3.癲癇急性期海馬區(qū)TLR4、Iκ

10、B-α的蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），LPS預(yù)處理可顯著增加TLR4、IκB-α表達(dá)（P＜0.05），對HMGB1的表達(dá)量無顯著性影響（P＞0.05），HMGB1總蛋白水平在各組間無顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.對照組海馬CA1區(qū)及CA3及均有少量的GFAP陽性細(xì)胞存在，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組與對照組比較GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均顯著性增加（P＜0.05），且模型Ⅱ組比模型Ⅰ組顯著性增加（P＜0.05）。
　　結(jié)論：