TLR4信號(hào)通路在脂多糖或鼠傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)的雛雞肝損傷中的作用.pdf

1、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為天然免疫中最為重要的一類模式識(shí)別受體，能夠特異性地識(shí)別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)——病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），從而激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。其中，TLR4廣泛表達(dá)于肝臟實(shí)質(zhì)及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，通過(guò)識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成分子脂多糖（lipopo lysaccharide，LP

2、S），對(duì)肝臟生理狀態(tài)的維持和病理過(guò)程的發(fā)展都起著至關(guān)重要的作用。有研究證實(shí)，LPS/TLR4信號(hào)通路參與了多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。然而，目前關(guān)于TLR4信號(hào)通路與肝損傷關(guān)系的研究大都集中在哺乳動(dòng)物上，且關(guān)于肝損傷后TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子的動(dòng)態(tài)變化鮮有報(bào)道。為此，本研究擬以1日齡科寶肉雞為研究對(duì)象，采用HE染色、變色酸2R染色、免疫組織化學(xué)染色和Q-PCR等方法研究LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝臟組織結(jié)構(gòu)、炎癥因子表達(dá)以及肝細(xì)胞凋亡的

3、動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)檢測(cè)TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)變化，為闡明TLR4信號(hào)通路與雛雞肝損傷之間的關(guān)系奠定分子基礎(chǔ)。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)和ALT活性的影響
　　為了研究LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝臟組織結(jié)構(gòu)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alaninetransaminase，ALT）活性的變化，本試驗(yàn)采用LPS或鼠傷寒沙門氏菌腹腔注射1日齡科寶肉雞。結(jié)果顯示:腹腔注射LPS6h、12h和

4、24 h后，肝臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的脂肪變性，肝竇中異嗜性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，注射后72 h和120 h時(shí)，主要表現(xiàn)為廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。鼠傷寒沙門氏菌刺激后，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，肝竇中異嗜性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著增多，但刺激后2 h和6h時(shí)未見(jiàn)明顯的病理變化，24 h和36 h時(shí)主要表現(xiàn)為脂肪變性，氣球樣變和淤血，72 h時(shí)門管區(qū)出現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激后ALT活性與對(duì)照組相比均顯著升高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后恢

5、復(fù)的趨勢(shì)，其中LPS刺激后12h達(dá)到峰值，鼠傷寒沙門氏菌刺激后24 h達(dá)到峰值。以上結(jié)果說(shuō)明，LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激可誘導(dǎo)雛雞肝臟的急性損傷。
　　2.LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)肝臟炎性因子表達(dá)的影響
　　為了研究LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝臟內(nèi)炎性因子的表達(dá)變化，本研究采用Q-PCR檢測(cè)了促炎因子TNF-α和IL-1β及抗炎因子TGF-β的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:LPS刺激后TNF-α、IL-1β和TGF-β的表達(dá)均呈

6、現(xiàn)先升高后恢復(fù)的趨勢(shì)，刺激后2h時(shí)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，6 h時(shí)開(kāi)始下降，但是始終高于對(duì)照組的表達(dá)水平。與TNF-α和IL-1β相比，TGF-β的增長(zhǎng)幅度較低。鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝臟炎性因子的表達(dá)同樣是表現(xiàn)為先升高后恢復(fù)的趨勢(shì)，抗炎因子和促炎因子表達(dá)都在24 h達(dá)到峰值，雖然同樣高于對(duì)照組的表達(dá)水平，但是不如LPS刺激之后的變化劇烈。以上結(jié)果顯示，LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激能夠?qū)е赂闻K抗炎因子和促炎因子的表達(dá)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷。此外，鼠傷

7、寒沙門氏菌刺激對(duì)炎性因子表達(dá)的影響比LPS要弱，這與肝臟組織結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果相符。
　　3.LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)肝細(xì)胞凋亡和增殖的影響
　　為了研究LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)肝細(xì)胞凋亡和增殖的影響，本研究采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)研究了ssDNA和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen, PCNA）在肝臟中的表達(dá)變化;采用caspase-3活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)了肝臟caspa

8、se-3的活性變化;采用Q-PCR檢測(cè)了肝臟caspase-3、caspase-8和PCNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:LPS刺激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡主要集中在刺激后的2h、6 h和12 h，刺激后24 h時(shí)細(xì)胞凋亡被明顯抑制，這與caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果一致:LPS刺激后肝臟caspase-3活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，12 h時(shí)達(dá)到峰值，2h、6h和12 h時(shí)高于對(duì)照組的caspase-3活性，達(dá)到極顯著水平，24 h時(shí)caspase-3

9、活性則顯著低于對(duì)照組。Caspase-3和caspase-8mRNA表達(dá)水平在LPS刺激后2 h達(dá)到峰值，6h時(shí)開(kāi)始下降，12h時(shí)顯著低于對(duì)照組表達(dá)水平。鼠傷寒沙門氏菌刺激后caspase-3和caspase-8 mRNA表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，但是鼠傷寒沙門氏菌刺激后未見(jiàn)caspase-3活性的顯著升高，且在12 h和24 h時(shí)caspase-3活性顯著低于對(duì)照組。LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激后PCNA表達(dá)均顯著降低，72 h和120

10、h時(shí)PCNA的表達(dá)則緩慢升高并接近對(duì)照組表達(dá)水平。以上結(jié)果說(shuō)明:LPS刺激能夠通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，并抑制肝細(xì)胞增殖導(dǎo)致肝損傷，且肝細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)活化的caspase-3介導(dǎo);鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝細(xì)胞凋亡處于抑制狀態(tài)，主要是通過(guò)抑制肝細(xì)胞的增殖導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生。
　　4.LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響
　　為了研究LPS或鼠傷寒沙門氏菌刺激對(duì)TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，采用免疫組織

11、化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)肝臟TLR4表達(dá)的變化規(guī)律;通過(guò)Q-PCR檢測(cè)TLR4及其信號(hào)通路下游分子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88，MyD88)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:LPS刺激后TLR4的表達(dá)呈現(xiàn)波浪形變化，刺激后6h時(shí)TLR4表達(dá)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，之后則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，24 h和36 h時(shí)低于對(duì)照組的表達(dá)水平，72 h和120

12、 h時(shí)則顯著高于對(duì)照組。鼠傷寒沙門氏菌刺激后TLR4的表達(dá)大體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，24 h時(shí)達(dá)到峰值，36 h時(shí)開(kāi)始降低，120 h時(shí)低于對(duì)照組的表達(dá)水平。LPS刺激后NF-κB的表達(dá)均高于對(duì)照組，刺激后2h達(dá)到峰值。鼠傷寒沙門氏菌刺激后肝臟NF-κB表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，120 h時(shí)下降到低于對(duì)照組的水平。LPS刺激后2h肝臟MyD88表達(dá)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，6h時(shí)開(kāi)始下降，36h時(shí)顯著低于對(duì)照組。鼠傷寒沙門氏菌刺激后MyD88表達(dá)