細菌性脂多糖誘導骨細胞凋亡及釋放HMGB1.pdf

1、背景和目的：
　　 骨細胞是骨組織中含量最多且生存時間最長的細胞類型。近年來的研究表明，骨細胞不是單純的沉默細胞。這些骨細胞通過骨小管相互聯(lián)系，在骨組織中形成密集的三維網(wǎng)絡，感知機械力、激素、炎癥因子等因素的變化，并且將這些變化信號通過骨小管傳遞給周圍的骨細胞以及骨內(nèi)表面的骨內(nèi)襯細胞，成骨細胞以及破骨細胞等，從而對刺激做出相應的反應。體內(nèi)外研究表明，骨細胞的活性對破骨細胞的生成和功能狀態(tài)有重要的調(diào)控作用，骨細胞在某些病理因素的作

2、用下會發(fā)生凋亡，凋亡的骨細胞又會誘導破骨細胞性骨吸收。骨細胞凋亡的信號如何傳遞給破骨細胞前體細胞及成熟的破骨細胞？長期以來，由于骨細胞難以分離、培養(yǎng)，該機制一直未得到闡明。
　　 近來，高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為信號分子介導炎癥和組織損傷的作用備受關(guān)注。HMGB1作為細胞核內(nèi)的非組蛋白作用于DNA的復制、重組、轉(zhuǎn)錄和修復，同時，它又可以被細胞分泌到細胞外參與到炎癥反應、免疫、細胞分化、細胞遷移、腫瘤發(fā)展和組織再生等。HM

3、GB1作為炎性因子可以刺激骨組織的吸收。也有體外實驗證實刺激骨細胞凋亡可以檢測到培養(yǎng)上清中HMGB1含量的增高。因此可以假設(shè)骨細胞感受到外界刺激并釋放HMGB1，同時HMGB1反過來會刺激破骨細胞進行骨吸收活動。本實驗采用脂多糖誘導小鼠骨細胞系MLO-Y4和小鼠成骨細胞系MC-3T3-E1的凋亡，觀察兩種細胞HMGB1的分泌情況。
　　 實驗方法：
　　 細胞培養(yǎng):復蘇培養(yǎng)小鼠骨細胞系和成骨細胞系細胞，細胞增殖到足夠?qū)嶒?/p>

4、使用數(shù)量后種六孔板，每孔4×105個細胞。種板后細胞采用不含血清的α-MEM培養(yǎng)，并加入脂多糖(LPS)刺激細胞凋亡，LPS的終濃度設(shè)為五個組別分別為0ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、5ug/ml和10ug/ml。標本收集檢測:按細胞接種后第6小時、18小時、24小時、48小時和72小時分別收取五個LPS濃度組別的細胞，固定后進行DAPI染色，觀察細胞核的變化，以此判斷細胞的凋亡狀況;另外收集細胞及培養(yǎng)上清進行HMGB1基因

5、表達的檢測和上清中分泌蛋白量的檢測。
　　 實驗結(jié)果：
　　 DAPI染色可以發(fā)現(xiàn)，MLO-Y4對LPS刺激的反應比較敏感而持久，MLO-Y4細胞的凋亡率呈現(xiàn)時間依賴性增加，48小時和72小時時細胞的凋亡率基本過半;MC-3T3細胞在18小時到24小時出現(xiàn)了一個凋亡高峰。ELISA檢測上清中的HMGB1含量發(fā)現(xiàn)小鼠骨細胞系MLO-Y4在18小時開始就有了顯著意義的增加，48小時分泌量達到頂峰，之后持平并有下降趨勢。小鼠成

6、骨細胞系MC-3T3-E1在18到24小時達到高峰狀態(tài)，之后HMGB1的含量逐漸下降，與凋亡率的變化呈現(xiàn)一致性。實時定量檢測發(fā)現(xiàn)在MLO-Y4中相對于對照組HMGB1mRNA的表達量增加也呈現(xiàn)時間依賴性，而MC-3T3組別僅在18小時到24小時的5μg/ml和10μg/mlLPS刺激組別出現(xiàn)了HMGB1mRNA表達量的增高。
　　 結(jié)論：
　　 細菌性脂多糖可以誘導小鼠骨細胞系MLO-Y4凋亡及釋放HMGB1，且后者呈現(xiàn)