人輔酶Ⅱ依賴性視黃醛脫氫-還原酶選擇性剪接亞型功能及選擇性翻譯起始位點(diǎn)的研究.pdf

1、NADP(H)依賴性視黃醇脫氫/還原酶（ NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase, NRDR）在人以及其他哺乳動(dòng)物中普遍表達(dá)，除參與維甲酸代謝外，對(duì)類固醇激素、α-雙羰基化合物等也顯示出不同的催化活性。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)兔NRDR對(duì)維生素K3有較強(qiáng)的催化活性，而其他哺乳動(dòng)物包括人NRDR在維生素K3的代謝中作用如何鮮有報(bào)道。之前的研究中，我們?cè)谌藢m頸鱗癌上皮細(xì)胞中鑒定出了NR

2、DR的選擇性剪接亞型NRDRB1，與NRDR相比，NRDRB1雖然缺失了第三外顯子編碼的34個(gè)氨基酸，但其作為還原酶所應(yīng)具備的重要功能模序均存在，NRDRB1的組織分布和生理功能至目前未見報(bào)道。在人NRDR mRNA的5’端含有兩個(gè)可能的翻譯起始位點(diǎn)（translational initiation site，TIS），理論上產(chǎn)生兩種不同的蛋白NRDR278和NRDR260，分別含有278和260個(gè)氨基酸。盡管我們檢測(cè)到生理?xiàng)l件下表達(dá)的

3、蛋白質(zhì)的表觀分子量與NRDR260的理論分子量相近，為27kDa，但由于NRDR278 N端存在線粒體定位信號(hào)，成熟的蛋白質(zhì)切除前導(dǎo)序列后的理論分子量也接近27kDa，故正常生理狀態(tài)下NRDR翻譯起始于第一個(gè)TIS還是第二個(gè)TIS目前仍無定論。
　　我們?cè)诒狙芯恐校海?）首先通過 RT-PCR和Western Blot檢測(cè)不同來源的細(xì)胞系中NRDRB1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人肝來源的細(xì)胞系中NRDRB1的表達(dá)量較高，通過cDNA末端快速

4、擴(kuò)增的方法在HL-7702細(xì)胞中克隆得到NRDRB1的全長(zhǎng)序列。（2）構(gòu)建NRDRB1的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)NRDRB1的融合蛋白，測(cè)定NRDRB1對(duì)α-雙羰基化合物和類固醇類激素的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，通過 HPLC進(jìn)一步檢測(cè) NRDRB1的催化活性并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示NRDRB1對(duì)帶有苯環(huán)的α-雙羰基化合物，特別是Benzil，具有比NRDR更強(qiáng)的催化活性。（3）用不同濃度的Benzil處理不同來源的細(xì)胞系，通過考察不同

5、細(xì)胞對(duì)Benzil的耐受力，發(fā)現(xiàn) NRDRB1的表達(dá)量高的細(xì)胞株能夠耐受更高濃度的Benzil。（4）誘導(dǎo)表達(dá)NRDR278融合蛋白，比較它與NRDR對(duì)α-雙羰基化合物的催化活性，結(jié)果顯示二者之間無明顯差異，提示兩個(gè)TIS之間的氨基酸并不參與功能結(jié)構(gòu)的形成而可能是信號(hào)序列。通過構(gòu)建 GFP融合表達(dá)質(zhì)粒對(duì) NRDR278進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn) N端GFP融合的NRDR278分布于過氧化物酶體，而C端GFP融合的NRDR278分布于線粒體。（5

6、）誘導(dǎo)表達(dá)人、豬、兔、大鼠和小鼠NRDR融合蛋白，檢測(cè)不同物種NRDR對(duì)維生素K3的催化活性顯示五種NRDR對(duì)維生素K3都具有催化活性，其中豬NRDR對(duì)維生素K3的催化活性最高。
　　綜上，本研究證實(shí)NRDRB1在人肝中表達(dá)豐富，并具有比NRDR更強(qiáng)的代謝帶苯環(huán)的α-雙羰基化合物的能力，與人體對(duì)此類化合物的解毒相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)證明人NRDR N端的氨基酸序列可引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體，推測(cè)人NRDR的翻譯可能起始于第一個(gè)TIS，并且人、