RBM5蛋白在mRNA選擇性剪接中作用機制的研究.pdf

1、真核生物細胞中基因的表達受到mRNA剪接的調(diào)控,而mRNA選擇性剪接保證了細胞中功能蛋白的多樣性。在真核細胞中,mRNA剪接調(diào)控的精確性和有效性至關(guān)重要,而mRNA剪接缺陷往往和許多人類疾病相關(guān)。RBM5蛋白最初作為腫瘤抑制因子而被發(fā)現(xiàn),RBM5蛋白過表達能夠通過促進細胞凋亡和抑制細胞周期進程影響細胞的分裂增殖。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)RBM5蛋白參與Fas、Caspase-2等細胞凋亡相關(guān)基因mRNA的選擇性剪接調(diào)控,但是具體調(diào)控機制仍然不

2、清楚。因此,本研究的主要目的在于探究RBM5參與mRNA選擇性剪接調(diào)控的可能機制,為更好地理解RBM5的生物學功能提供線索。
　　 1.RBM5蛋白對hAID mRNA選擇性剪接的調(diào)控
　　 AID(Activation Induced Deaminase,活化誘導胞嘧啶核苷脫氨酶)是B細胞中類別轉(zhuǎn)換(classs switch recombination)和體細胞高頻突變(somatichypermutation)兩個

3、過程所必需的,然而AID的不正常表達和B細胞淋巴瘤、肺癌、直腸癌等腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)AID mRNA選擇性剪接是其生物學功能的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。為了研究AID選擇性剪接的調(diào)控機制,首先構(gòu)建了含人AID第3、4、5外顯子對應基因組DNA片段的真核表達載體。研究發(fā)現(xiàn)RBM5能夠調(diào)控上述AID迷你基因的選擇性剪接,促進外顯子4的跳躍。我們進一步發(fā)現(xiàn),RBM5蛋白的調(diào)控功能依賴于內(nèi)含子3的3’剪接位點的強度。體外遷移率變動分析

4、(gel mobility shift assay)實驗結(jié)果表明,RBM5重組蛋白在體外能夠結(jié)合AID mRNA,很可能是通過結(jié)合在內(nèi)含子3的3’剪接位點上游發(fā)揮作用,提示RBM5蛋白可能通過結(jié)合在受調(diào)控外顯子相關(guān)上游3’剪接位點附近,阻止剪接復合體對該3’剪接位點的識別,從而抑制相應內(nèi)含子的剪切,促進外顯子跳躍。
　　 2.關(guān)于RBM5蛋白相互作用的研究
　　 mRNA剪接調(diào)控一般是通過RNA—RNA、RNA-蛋白、蛋

5、白-蛋白相互作用實現(xiàn)的。為了探尋與RBM5剪接調(diào)控相關(guān)的蛋白,本研究首先通過親和純化的方法從HeLa細胞核抽提物中分離了RBM5蛋白復合物,質(zhì)譜分析鑒定出兩個新的RBM5結(jié)合蛋白:DHX15和PRP19。免疫共沉淀和體外GST pulldown實驗結(jié)果證實了RBM5蛋白能夠結(jié)合DHX15和PRP19。已有研究表明,人DHX15的酵母同源蛋白Prp43p主要參與剪接體的解聚及核糖體rRNA的成熟,但DHX15在哺乳動物細胞中的作用目前尚不

6、清楚。鑒于此,我們對RBM5與DHX15相互作用及其生物學意義進行更為深入的探索。首先,酵母雙雜交和免疫共沉淀實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),RBM5 C端結(jié)構(gòu)域是RBM5與DHX15間相互作用所必需的。進一步的點突變實驗結(jié)果表明,RBM5 C端的Gpatch結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗BM5與DHX15間的相互作用起到重要作用。
　　 最后,通過體外實驗首次證實DHX15在體外具有解旋酶活性,而RBM5通過其G patch結(jié)構(gòu)域促進DHX15的解旋酶活性。本研