核酸載體精胺化普魯蘭在抗腫瘤RNA干擾中的作用研究.pdf

1、目的:RNA干擾(RNAi)技術在多種蛋白表達相關的疾病或病毒感染的治療中具有應用前景。實現(xiàn)RNAi的關鍵條件之一是獲得具有RNA藥物高裝載量和高轉染效率、無毒且無免疫原性、并易于商業(yè)化生產(chǎn)的載體。非病毒型載體具有易化學合成、低免疫原性、保護siRNA免于降解等優(yōu)勢。在眾多非病毒載體中，陽離子多糖具有良好的生物相容性并且易修飾，一直是核酸載體的研發(fā)重點之一。但是，在遞送siRNA過程中，陽離子多糖會與血清蛋白發(fā)生非特異性結合，從而影響R

2、NA干擾效率。為了減少血清蛋白的影響，通常需要使用無血清條件培養(yǎng)細胞。然而，在無血清環(huán)境中，陽離子多糖又會通過靜電相互作用而與細胞膜發(fā)生非特異性結合，由此而導致嚴重的細胞毒性;此外，當在體內應用時，無血清環(huán)境的要求也無法中得到滿足。
　　慢性髓系白血病(CML)是由造血干細胞染色體移位而產(chǎn)生融合基因BCR-ABL所導致的血液惡性腫瘤。CML的主要治療方法為激酶抑制劑和異體造血干細胞移植，但患者會逐漸對激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥，同時還有部

3、分患者對藥物不耐受。越來越多的研究致力于將RNA干擾技術應用于CML的治療，但是，面臨著CML細胞難以轉染的挑戰(zhàn)。目前對CML細胞轉染的方法主要包括電穿孔和病毒載體兩種。但是，電穿孔轉染不能用于體內實驗，而病毒載體具有引起免疫反應的風險，并且易引起宿主基因突變，因此，迫切需要研發(fā)針對CML細胞的新型載體。
　　精胺化普魯蘭多糖（Pullulan-spermine，Ps）是一種典型的陽離子多糖，由于其特有的化學成分而在肝臟細胞的RN

4、Ai中得到廣泛研究。實驗室之前的研究結果顯示，培養(yǎng)基中的血清濃度會影響Ps與siRNA所形成的復合物(Ps/siRNA)被乳腺癌細胞攝取的數(shù)量及其溶酶體逃逸能力，由此而影響RNA干擾效率，但是關于血清蛋白(Pr)與Ps的相互作用及Pr與Ps的質量比(Pr/Ps)與RNAi之間的關系尚需要深入研究。此外，尚未有研究報道Ps在血液惡性腫瘤RNAi中的應用。本研究用Ps作為模型陽離子多糖載體，開展以下兩方面的研究:(1)Ps對蛋白分子的吸附作

5、用以及Pr/Ps對Ps/siRNA復合物的粒徑和RNA干擾效率的調控作用;(2)以Ps為siRNA載體，沉默CML細胞功能基因BCR-ABL，并比較Ps在CML細胞、RAW264.7和Jurkat細胞上引起的RNA干擾效率的差異。
　　方法:采用等溫滴定量熱法研究Ps與牛血清白蛋白(BSA)之間的吸附作用，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測Ps/siRNA復合物的形成，以及BSA對Ps與siRNA結合穩(wěn)定性的影響;通過動態(tài)光散射實驗(DLS)

6、研究溶液體系中Pr/Ps對Ps/siRNA復合物顆粒尺寸的影響。以MDA-MB-231和MDA-MB-231-EGFP細胞為模型，用流式細胞術和激光共聚焦顯微術檢測Pr/Ps對復合物進入細胞的影響和對RNA干擾效率的影響。應用RT-PCR技術研究血清對Ps、Lipo3000介導β-actin/BCR-ABL siRNA對K562、KU812、MEG-01、RAW、Jurkat細胞的RNA干擾效率的影響;以Ps/PGL4.51轉染K562

7、、RAW、Jurkat細胞，并用微孔板塊熒光檢測儀檢測Luc的表達量。
　　結果:Ps與siRNA完全結合的質量比為0.75∶1。在溶液中Ps會吸附BSA分子，但BSA的吸附不影響Ps/siRNA的穩(wěn)定性。在一定siRNA質量范圍內，隨著Pr/Ps的增大，Ps/siRNA的粒徑減小，同時，復合物Ps/siRNA進入細胞的能力、對細胞的毒性和介導基因沉默的效率也逐漸降低;在Pr/Ps固定的條件下，隨siRNA量的增加，RNA干擾效率

8、逐漸提高，當siRNA濃度達到1μg/mL后，RNA干擾效率不再增加。在Ps/siRNA與細胞共孵育后，使用氯喹(CQ)處理細胞，可使RNA干擾效率進一步提高。
　　當N/P為2.5時，復合物Ps/siRNA的粒徑不受培養(yǎng)基中血清濃度的影響。同時，無論在無血清培養(yǎng)基中還是在有血清培養(yǎng)的條件下，K562的細胞活性都在80％以上;Ps/FAM-siRNA在3種CML細胞上的陽性率均大于95％，而在RAW和Jurkat兩種細胞上的陽性率

9、在85％左右。
　　對5種細胞的β-actin基因進行RNA干擾，在Opti-MEM培養(yǎng)基條件下，Ps在3種CML細胞上介導的干擾效率高于Lipo3000，在RAW、Jurkat細胞上低于Lipo3000;在10％的血清濃度條件下，Lipo3000和Ps介導的干擾效率均很低。對3種CML細胞的BCR-ABL基因進行RNA干擾，在上述兩種培養(yǎng)基條件下，載體Ps在K562細胞上介導的干擾效率明顯高于Lipo3000;對于KU812細胞

10、，Ps與Lipo3000介導的干擾效率沒有差異;對于MEG-01細胞，在Opti-MEM培養(yǎng)基條件下，Ps介導的干擾效率高于Lipo3000，而在10％血清濃度條件下，低于Lipo3000。
　　當N/P為2.5時，Ps在K562及其耐藥株上介導的RNA干擾效率不受血清濃度影響，但在HELA細胞上介導的干擾效率則隨血清濃度的增加而降低。此外，Ps/PGL4.51在K562細胞上介導的熒光素酶的表達量高于在RAW和Jurkat細胞上