海洋普魯蘭短梗霉hn6.2菌株鐵載體合成與調(diào)控的研究

1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文海洋普魯蘭短梗霉H N 6 ．2 菌株鐵載體合成與調(diào)控的研究學(xué)位論文完成日期：指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會成員簽字：中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文海洋普魯蘭短梗霉H N 6 ．2 菌株鐵載體合成與調(diào)控的研究摘 要普魯蘭短梗霉( A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) H N 6 ．2 菌株由海洋環(huán)境中分離獲得，為一株可高產(chǎn)異羥肟酸類鐵載體F u s i g e n 的海洋

2、酵母。在最優(yōu)條件下，其鐵載體產(chǎn)量最高可達(dá)到0 ．4 4 m M ，在培養(yǎng)基中添加F e 3 + 后該菌株鐵載體的產(chǎn)量明顯減少，該菌株所產(chǎn)鐵載體對海洋鰻弧菌和海洋副溶血弧菌具有明顯的抑菌活性。但是目前其他實(shí)驗(yàn)室還未在分子水平上對該菌株鐵載體合成與調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。F u s i g e n 鐵載體的合成途徑起始于L 一鳥氨酸一N 5 ．羥基化，由L 一鳥氨酸．N 5 ．單加氧酶催化，形成N 5 ’羥基L ．鳥氨酸，即鐵載體的基本結(jié)構(gòu)單元。

3、數(shù)個該結(jié)構(gòu)基本單元在非核糖體肽合成酶( N l 沖S s ) 的催化下組裝為鐵載體，所以L 一鳥氨酸．N 5 一單加氧酶催化該鐵載體合成反應(yīng)的第一步反應(yīng)。為了研究該酵母菌鐵載體合成和調(diào)控的功能基因，本研究構(gòu)建了該菌株的基因敲除元件。該元件由T E F 啟動子，潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因( 胛丁基因) 和特定終止子序列( p o l y A ) 構(gòu)成，將該元件命名為p G D M l A P 一1 。在該元件的兩端連接上來自該菌株的蛋白酶基

4、因5 ’．端同源重組片段( 5 ' - a r m ) 和3 ’一端同源重組片段( 3 ' - a r m ) 后得到堿性蛋白酶基因敲除載體，該敲除載體轉(zhuǎn)化到H N 6 ．2 菌株細(xì)胞后，獲得的敲除菌株堿性蛋白酶活性大幅下降，說明基因敲除元件p G D M I A P ．1 在H N 6 ．2 菌株中可以正常起作用，敲除載體構(gòu)建成功。在本研究中，通過反向P C R 和R T ．P C R 的方法克隆了催化H N 6 ．2

5、 菌株鐵載、-體合成途徑第一步反應(yīng)的L ．鳥氨酸．N 5 ．單加氧酶( L ．鳥氨酸．N 5 ．羥化酶) 基因，將該基因命名為S i d A ，該基因G e n B a n k 登錄號為F J 7 6 9 1 6 0 。該基因O I 訌長度為1 4 6 1 b p ，無內(nèi)含子，編碼4 8 6 個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為7 ．7 9 ，分子量為5 5 4 2 1 。該基因上游啟動子包含一個C A A T 盒和兩個轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn)G