VEGF-C和Survivin在胃癌中的表達(dá)及其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、目的:
　　胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌的發(fā)病率高居世界首位。目前我國(guó)早期胃癌診斷率極低，局部進(jìn)展與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性胃癌約占60～80％，是當(dāng)前治療的重點(diǎn)與難點(diǎn)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)早期事件和獨(dú)立的預(yù)后因素，因此闡明胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，早期預(yù)測(cè)和診斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，尋找新的分子治療靶點(diǎn)進(jìn)行有效干預(yù)與阻斷治療，對(duì)提高胃癌患者的5年生存率具有重要意義。生理情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡間保持動(dòng)態(tài)平衡，維持其正常

2、的結(jié)構(gòu)和功能。這種平衡有賴于癌基因、抑癌基因，以及某些調(diào)節(jié)肽等的調(diào)控，一旦癌基因被激活而抑癌基因被抑制，促使增殖加快，DNA損傷得不到修復(fù)，而凋亡機(jī)制不能相應(yīng)啟動(dòng)，使細(xì)胞獲永生，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞進(jìn)而最終進(jìn)展到癌。因此，深入研究細(xì)胞周期的信號(hào)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　Survivin基因是凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成員，能抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，Survivin也是與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)的凋亡調(diào)

3、節(jié)因子。已有研究表明，Survivin的表達(dá)與胃癌等多種惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin的另一作用是能夠促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。實(shí)驗(yàn)顯示靶向抑制survivin的表達(dá)后，可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和阻止新生血管生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Survivin的這個(gè)作用被發(fā)現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的VEGF-C有密切關(guān)系。
　　VEGF-C屬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員，是胚胎組織和成熟個(gè)體淋巴管生成的唯一調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)與淋巴

4、內(nèi)皮細(xì)胞上的同族受體酪氨酸激酶VEGFR-3特異性結(jié)合，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，激活Ras-MAPK途徑，介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部及周圍新生淋巴管形成，促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，同時(shí)還可以使已形成的淋巴管擴(kuò)張，從而有利于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。目前，在胃癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達(dá)與淋巴管的生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至患者的預(yù)后呈正相關(guān)。
　　綜上所述，Survivin和VEGF-C都具有促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)

5、轉(zhuǎn)移的作用，但是兩者之間是否存在聯(lián)系尚缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文擬通過(guò)研究Survivin與VEGF-C在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中表達(dá)的相互關(guān)系，從而深入探討Survivin和VEGF-C在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的重要作用，為胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移情況預(yù)測(cè)和病情評(píng)估找到合適的指標(biāo)，并為治療胃癌淋巴轉(zhuǎn)移提供準(zhǔn)確的靶向目標(biāo)。
　　材料和方法:
　　1、利用胃癌組織芯片分析了195例胃癌組織標(biāo)本中Survivin和VEGF-C的表達(dá)情況，以及它們與患者

6、的臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行預(yù)后分析。觀察Survivin和VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性。
　　2、構(gòu)建攜帶針對(duì)Survivin和VEGF-C的shRNA質(zhì)粒載體。通過(guò)脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SGC-7901胃癌細(xì)胞中。
　　3、設(shè)計(jì)空白對(duì)照組，陰性質(zhì)粒對(duì)照組，Survivin-shRNA質(zhì)粒組，VEGF-C-shRNA質(zhì)粒組。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Survivin和VEGF-C在不同組別中的蛋白水平的表達(dá)。通過(guò)r

7、eal-time PCR檢測(cè)Survivin和VEGF-C在不同組別中的mRNA水平的表達(dá)。
　　4、應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕法細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell法基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-Survivin重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移以及侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化結(jié)果顯示，Survivin及VEGF-C在胃癌組織中的表達(dá)率分別為51.3％和55.4％，主要在胃癌細(xì)

8、胞胞漿中表達(dá)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，Survivin和 VEGF-C的表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移患者（P值分別為0.008和0.001）。Survivin與VEGF-C的表達(dá)均與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。另外，Survivin與VEGF-C共同高表達(dá)的患者預(yù)后更差。
　　2、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:Survivin蛋白的表達(dá)不受VEGF-C的調(diào)控，而VEGF-C的蛋白表達(dá)則受到Survivin表達(dá)的影響，且呈

9、正相關(guān)。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:在mRNA水平，Suvivin的表達(dá)不受VEGF-C的表達(dá)調(diào)控，而VEGF-C的表達(dá)則受到Survivin表達(dá)的影響，且呈正相關(guān)。該結(jié)果與Western blot基本一致。
　　3、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質(zhì)粒對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效應(yīng)，細(xì)胞貼壁后24h開(kāi)始細(xì)胞增殖受到抑制，36h時(shí)細(xì)胞抑制極為明顯(p＜0.01)。劃

10、痕法細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，Survivin沉默組遷移能力明顯減弱。Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質(zhì)粒的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，發(fā)現(xiàn)其侵襲能力比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1、在胃癌組織中，Survivin與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Surv

11、ivin和VEGF-C高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后不良。
　　2、在胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Survivin參與調(diào)節(jié)VEGF-C的表達(dá)，而Survivin的表達(dá)卻不受VEGF-C表達(dá)的影響。
　　3、構(gòu)建的Survivin-shRNA真核表達(dá)載體能夠特異、高效的抑制胃癌細(xì)胞Survivin基因和蛋白的表達(dá)，并可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　4、Survivin和VEGF-C可能為治療胃癌淋巴轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供準(zhǔn)確的靶向