VEGF-C在survivin介導(dǎo)的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 乳腺癌是在當(dāng)前女性患者中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞向全身擴(kuò)散的一個(gè)重要途徑。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的一個(gè)成員,它負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)兩個(gè)重要的細(xì)胞過(guò)程,即抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖。Survivin在胎兒發(fā)育時(shí)期呈高表達(dá),但在健康的成人正常組織中表達(dá)極少。然而,在大多數(shù)惡性腫瘤中,其又是高表達(dá)的。因此survivin可以作為

2、一個(gè)潛在腫瘤標(biāo)記物同時(shí)也可以作為腫瘤治療的靶標(biāo)。同時(shí),survivin也是與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)因子。已有研究表明,survivin的表達(dá)與乳腺癌等多種惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 VEGF-C(Vascular endothelial growth factor-C)是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員之一,也是調(diào)節(jié)淋巴管生成的重要因子。VEGF-C是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的淋巴管生成相關(guān)因子,其通過(guò)與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上的同族受體

3、酪氨酸激酶VEGFR-3。對(duì)不同類型的腫瘤進(jìn)行的研究表明,上調(diào)VEGF-C的表達(dá)能促進(jìn)腫瘤淋巴管的形成并增加腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率。VEGF-C的表達(dá)能在腫瘤的內(nèi)部或者周圍形成大量的淋巴管道,以此來(lái)促進(jìn)腫瘤向淋巴結(jié)甚至遠(yuǎn)處的器官轉(zhuǎn)移。此外,VEGF-C也能在淋巴結(jié)中促進(jìn)形成新的淋巴管。在化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚癌變模型中,研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C促使的前哨淋巴結(jié)腫淋巴管網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)張是先于腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的。目前,在胃癌,結(jié)直腸癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)VEGF

4、-C的表達(dá)與淋巴管道的生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至患者的預(yù)后呈正相關(guān)。
　　 Survivin的另一被證明的作用是能夠促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的生成。實(shí)驗(yàn)顯示靶向抑制survivin的表達(dá)后,可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和阻止新生血管生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Survivin的這個(gè)作用被發(fā)現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的VEGF有密切關(guān)系。
　　 如上所述,survivin和VEGF-C在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中所起到的作用已經(jīng)被認(rèn)知,然而,兩者之間是

5、否存在聯(lián)系的討論尚缺乏。本文擬通過(guò)研究survivin與VEGF-C在乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌組織和乳腺癌腋窩淋巴結(jié)中表達(dá)的相互關(guān)系,從而深入探討survivin和VEGF-C在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的重要作用,為乳腺癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移情況預(yù)測(cè)和病情評(píng)估找到合適的指標(biāo)。并為治療乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供準(zhǔn)確的靶向目標(biāo)。
　　 材料和方法：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30和人乳腺癌組織、腋窩淋巴結(jié)組織。<

6、br>　　 2、構(gòu)建攜帶針對(duì)survivin和VEGF-C的shRNA質(zhì)粒載體和攜帶擴(kuò)增survivin的慢病毒載體。通過(guò)脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到ZR-75-30乳腺癌細(xì)胞中。按MOI=20將慢病毒轉(zhuǎn)染到ZR-75-30乳腺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染成功后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)來(lái)檢測(cè)質(zhì)粒和慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。
　　 3、設(shè)計(jì)空白對(duì)照組,陰性質(zhì)粒對(duì)照組,陰性慢病毒對(duì)照組,survivin-shRNA質(zhì)粒組,VEGF-C-shRNA

7、質(zhì)粒組,survivin慢病毒組和survivin慢病毒轉(zhuǎn)染VEGF-C-shRNA質(zhì)粒組。
　　 4、通過(guò)蛋白質(zhì)電泳觀察survivin和VEGF-C在不同組別中的蛋白水平的表達(dá)。
　　 5、通過(guò)real-time PCR技術(shù)觀察survivin和VEGF-C在不同組別中的mRNA水平的表達(dá)。
　　 6、使用Transwell小室,通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染survivin慢病毒和VEGF-C-shRNA質(zhì)粒的

8、乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力的變化。
　　 7、收集乳腺癌組織和腋窩淋巴結(jié)組織樣本,通過(guò)免疫組織化學(xué)分析survivin和VEGF-C在108例乳腺癌組織和腋窩淋巴組織的表達(dá)情況,以及它們與患者的臨床病理特征之間的關(guān)系,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀察survivin和VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性及兩者表達(dá)與乳腺癌患者陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ZR-75-30細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,質(zhì)粒感染

9、率為70%。
　　 2、經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的ZR-75-30細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,慢病毒感染率為100%。
　　 3、蛋白質(zhì)電泳發(fā)現(xiàn)經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)survivin和VEGF-C水平降低,經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)survivin水平升高。
　　 4、在蛋白水平和mRNA水平,VEGF-C在ZR-75-30細(xì)胞中的表達(dá)隨survivin表達(dá)的升高而升高,隨survivin表達(dá)的降低而降低。其中,mRNA水平

10、上,在survivin-shRNA質(zhì)粒組和survivin慢病毒組中VEGF-C的表達(dá)與空白對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯下降(p＜0.05)和升高(p＜0.05)。
　　 5、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中,survivin慢病毒組的侵襲細(xì)胞數(shù)目(72,±3.06)高于空白對(duì)照組(30,±5.29)(p＜0.05),慢病毒轉(zhuǎn)染VEGF-C-shRNA質(zhì)粒組的侵襲細(xì)胞數(shù)目(27,±3.61)低于survivin慢病毒組(72,±3.06)(p＜0.05)。

11、
　　 6、免疫組化結(jié)果顯示,在乳腺癌組織中,VEGF-C的表達(dá)與survivin表達(dá)密切相關(guān)(p＜0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,survivin和VEGF-C的共表達(dá)高于任一指標(biāo)的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程中,survivin參與調(diào)節(jié)VEGF-C的表達(dá)。
　　 2、VEGF-C能夠調(diào)控survivin介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 3、在乳腺