嗜熱子囊菌光孢變種熱穩(wěn)定蛋白酶的基因克隆和表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白酶是一類在生理學(xué)和商業(yè)領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用價值的酶，其在食品和清潔劑中的應(yīng)用具有悠久的歷史。微生物來源的蛋白酶，由于培養(yǎng)簡便，產(chǎn)量豐富，適于工業(yè)化生產(chǎn)而得以廣泛應(yīng)用。但一般的蛋白酶熱穩(wěn)定性較差，在應(yīng)用中易于失活，因此熱穩(wěn)定性蛋白酶的研究和開發(fā)具有重要的商業(yè)價值。對于熱穩(wěn)定蛋白酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)成為當(dāng)前蛋白酶研究的熱點問題。 嗜熱菌是一類在高溫、高pH條件下可以很好生長的微生物，其產(chǎn)生的酶類也具有相應(yīng)的性質(zhì)，有較好的熱穩(wěn)定

2、性和pH穩(wěn)定性。嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)是一種生長上限溫度較高的嗜熱真菌，能夠在45℃～50℃的高溫下很好的繁殖生長。從該菌中已分離了多種嗜熱酶，其以酪蛋白為誘導(dǎo)物培養(yǎng)可分泌蛋白酶，但未見該菌絲氨酸蛋白酶的報道。 本研究以嗜熱子囊菌光孢變種為出發(fā)菌株，根據(jù)真菌蛋白酶的同源保守序列設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR、快速擴增cDNA末端及熱不對稱PCR等方法，

3、克隆了該蛋白酶的編碼基因Tapro，全長DNA為2704bp，包含一個由494個氨基酸組成的開放閱讀框。該基因cDNA已在GenBank中注冊，登錄號為EU364816。通過分析，該蛋白酶為絲氨酸蛋白酶枯草桿菌S8家族，含有Asp183/Ser384/His215催化三聯(lián)體，并具有枯草桿菌蛋白酶家族的兩個保守區(qū)，這與絲氨酸蛋白酶家族催化活性有關(guān)。 Tapro基因和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K雙酶切后體外連接，構(gòu)建酵母重組表達(dá)

4、載體pPIC9K/Tapro，將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/Tapro用限制性內(nèi)切酶XbaI(位于HIS4區(qū)內(nèi))線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測及G418抗性篩選得到多拷貝整合子，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來篩選高效表達(dá)目的蛋白酶的工程菌株。篩選到表達(dá)酶活性最高的菌株GS-TAPRO-18，甲

5、醇誘導(dǎo)7d酶活性達(dá)到最高，達(dá)178.92U/mL。檢測目的蛋白的表達(dá)量，并測定表達(dá)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)，該酶可以被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF抑制，具有廣譜的底物適用性。表達(dá)蛋白酶Tapro的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和8.0，該酶在60℃以下穩(wěn)定，70℃的保溫60min仍具有60％的酶活性；在pH值為6.0～12.0之間保持穩(wěn)定的酶活性。 酵母工程菌株GS-TAPRO-18能在甲醇的誘導(dǎo)下分泌出具生物活性的蛋白酶，這就預(yù)示了表