嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定β-1，3-葡聚糖酶的基因克隆、表達及性質(zhì)研究.pdf

1、β-1，3-葡聚糖酶是一類能夠特異作用于β-葡聚糖中β-1，3糖苷鍵的葡聚糖水解酶系。β-1，3-葡聚糖酶大體上可以分為兩類：外切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.58）和內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.6或EC3.2.1.39）。β-1，3-葡聚糖酶廣泛分布和存在于病毒、細菌、絲狀真菌、放射菌類、酵母、軟體動物和高等植物中。在啤酒工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)療和植物抗病等方面有大量應(yīng)用。
　　 嗜熱毛殼菌（Chaetomi

2、um thermophilum）是一種廣泛分布的嗜熱真菌，其生長上限溫度很高，產(chǎn)生的嗜熱酶在高溫條件下具有很高的活性和穩(wěn)定性，該菌在含有麥麩的培養(yǎng)基中，50℃條件下可以產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖酶。目前已從該菌中分離純化了熱穩(wěn)定的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶等，但未見該菌β-1，3-葡聚糖酶的完整報道。
　　 本研究以嗜熱毛殼菌為研究材料，根據(jù)已得到β-1，3-葡聚糖酶的中間片段，設(shè)計特異引物，通過RACE-PCR和熱不對稱交錯PCR

3、等方法，克隆了該β-1，3-葡聚糖酶的編碼基因glu-n，全長cDNA2765bp，包含一個由786個氨基酸組成的開放閱讀框。該基因cDNA已在GenBank中注冊，登錄號為GQ149728。
　　 glu-n基因和酵母分泌型表達載體pPIC9K用SnaBⅠ和AvrⅡ雙酶切后體外連接，構(gòu)建酵母重組表達載體pPIC9K/glu-n，將重組表達質(zhì)粒pPIC9K/glu-n用限制性內(nèi)切酶SacⅠ（位于5'AOX1區(qū)內(nèi)）線性化后，采用電

4、擊法轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細胞，于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測及G418抗性篩選得到多拷貝整合子，進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達情況來篩選高效表達目的蛋白的工程菌株。篩選到表達酶活性最高的菌株4-60，甲醇誘導(dǎo)7d酶活性達到最高，達257.379U/mL。
　　 表達的β-1，3-葡聚糖酶進行硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose

5、 Fast Flow陰離子層析獲得了凝膠電泳均一的分子量約為94kDa的β-1，3-葡聚糖酶。表達β-1，3-葡聚糖酶GLU-N的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和5.0，70℃的保溫60min仍具有60％的酶活性；在pH值為4.0～7.0之間保持穩(wěn)定的酶活性。β-1，3-葡聚糖酶對輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioide）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）的菌絲生長有一定的抑制作用。對嘴突凸臍蠕