嗜熱子囊菌光孢變種幾丁質(zhì)酶基因的克隆和表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)廣泛分布于動(dòng)物、微生物體內(nèi),是自然界中含量?jī)H次于纖維素的生物多聚物。其專一性水解酶——幾丁質(zhì)酶(chitinase)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),它除了被用于植物病原真菌和害蟲(chóng)的生物防治,還可以用作外敷藥物治療由真菌引起的人類疾?。豢梢灾苽浣湍负徒z狀真菌的原生質(zhì)體。分離幾丁質(zhì)酶基因、構(gòu)建高效表達(dá)工程菌,對(duì)實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。 嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus aurantiacus vat. levispor

2、us)是一種廣泛分布的,生長(zhǎng)上限溫度較高的嗜熱真菌,能夠在45℃～50℃的高溫下很好的繁殖生長(zhǎng)。本文以嗜熱子囊菌光孢變種為材料,根據(jù)已獲得的幾丁質(zhì)酶基因中間片段,通過(guò)RACE技術(shù)獲得了嗜熱子囊菌光孢變種的幾丁質(zhì)酶的全長(zhǎng)基因Tachit,該基因已在GenBank中注冊(cè),登錄號(hào)為EF608144。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET22b(+)/Tachit并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coil BL21,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測(cè),在約44

3、kDa處有一條明顯的蛋白帶,可溶性分析結(jié)果顯示,其表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。另外分別構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K/Tachit和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K/Tachit并轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115,得到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工程菌株。通過(guò)甲醇誘導(dǎo),對(duì)酶液進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose FastFlow陰離子層析獲得了凝膠電泳均一的分子量約為45kDa幾丁質(zhì)酶。重組幾丁質(zhì)酶TACHIT的最適反應(yīng)溫度和