非對稱和對稱IVIG對小鼠黑色素瘤的預防和治療機制研究.pdf

1、目的：
　　免疫球蛋白G(IgG)是一類具有抗體活性可與對應抗原特異性結合的一類球蛋白，而靜脈注射免疫球蛋白G(IVIG)其生產來源自至少1000名以上健康獻血志愿者，所得血漿進行混合，分離，再提純而來的。所以說IVIG是一種具有抗體活性并且含有廣譜抗菌和抗病毒作用的IgG總和。Margni RA等課題組在20世紀80年代發(fā)現(xiàn)在IgG分子中存在一種異常糖基化的IgG，這種免疫球蛋白在其Fab段的一端存在糖基，而另一端沒有，使得Ig

2、G分子不對稱，我們稱之為非對稱 IgG。這種非對稱IgG只能與抗原單價結合，其結合能力比對稱IgG弱百倍，并且不能引起下游有效的免疫效應發(fā)生，如CDC、ADCC等。黑色素瘤又被稱為惡性黑色素瘤，其惡性性程度高，侵襲性強，遠處轉移發(fā)生早，是威脅患者生命健康的最主要因素。相關研究報道，IVIG在動物腫瘤轉移模型中對腫瘤在體內的生長和轉移起到了明顯的抑制作用。但關于IVIG對腫瘤的預防是否有效及其在體內IgG如何產生作用尚無確切報道。在本次研

3、究中，我們探索了IVIG和非對稱IgG對于小鼠黑色素瘤肺轉移的預防作用和對生存期的影響作用及其可能的作用機制。
　　方法：
　?、懦砷L至7到8周齡的C57BL/6雌鼠均訂購于北京市維通利華實驗動物公司，空運至汕頭大學醫(yī)學院并飼養(yǎng)于汕大醫(yī)學院實驗動物中心的SPF級實驗動物房。⑵注射使用的小鼠黑色素瘤細胞B16F10均訂購于武漢Procell生命科技有限公司，培養(yǎng)于培養(yǎng)基為胎牛血清濃度為10％的DMEM培養(yǎng)基中，置于CO2濃度為

4、5%，溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。⑶訂購于北京索萊寶科技有限公司的小鼠干粉IgG，儲存于-20℃冰箱內，用PBS溶液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。人IVIG為上海萊士公司生產，儲存于4℃冰箱內，用PBS稀釋，調PH至7.4。⑷將用PBS溶解稀釋后的IgG,反復經過裝有rProteinG的親和層析柱，結合在層析柱上的即為純凈的總IgG。⑸將提純所得的總IgG熱變性后，進行SDS-PAGE電泳，使用硝酸銀染色顯示電泳條帶，用來鑒定目的蛋白條帶的純度。⑹將

5、購買來的7到8周齡的C57BL/6雌鼠采用尾靜脈注射的方法注射1.5×105，2.0×105個B16F10細胞，一般腫瘤在第15天會形成肺轉移灶。利用該動物模型進行預防實驗設計。⑺選取黑色素瘤的特異抗體ki67、gp100、mmp-2和mmp-9來對肺組織進行免疫組化染色，并對其陽性率進行統(tǒng)計學分析，來判斷IVIG對小鼠黑色素瘤肺轉移的預防作用。⑻采用R&D公司的Mouse Cytokine Array Kit小鼠細胞因子蛋白芯片試劑盒

6、，對各組間分泌的炎性因子進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　?、侔凑丈鲜鼋７椒ǎ∈蟮暮谏亓龇无D移成瘤率為100%。②經銀染鑒定，本實驗中所用到的小鼠 IgG與人 IgG由兩條帶構成且無明顯混雜蛋白條帶。③IVIG預防性注射可以有效的抑制小鼠黑色素瘤的肺轉移的發(fā)生。④對稱IgG對小鼠黑色素瘤肺轉移的抑制作用較好于非對稱IgG對小鼠黑色素瘤肺轉移的抑制作用。⑤未進行IVIG預防性注射的小鼠肺組織免疫組化顯示 ki67和 gp1

7、00的陽性率明顯高于預防組的小鼠。⑥預防性接種低劑量的IVIG可以有效抑制黑色素瘤細胞的增殖同時抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達。⑦經蛋白芯片檢測小鼠血漿內的細胞因子，得出以下結論：IVIG可以刺激小鼠并促進機體產生 BLC,IL-1ra；IVIG可以抑制小鼠機體產生IP-10,JE,KC,MIP-2,TIMP-1,TNF-a。
　　結論：
　　預防性注射IVIG可以有效的抑制黑色素瘤在小鼠體內的肺轉移，而IVIG起到預