抗豬脂肪細(xì)胞膜基因工程抗體的研究.pdf

1、隨著人們對(duì)健康問(wèn)題的日益重視,減少動(dòng)物體內(nèi)過(guò)量的脂肪已成為人們普遍關(guān)注的問(wèn)題.過(guò)量的脂肪不僅降低了肉的品質(zhì),而且不利于人類(lèi)健康.人體攝入過(guò)量的動(dòng)物性脂肪會(huì)導(dǎo)致肥胖癥和心腦血管疾病,對(duì)人體的健康危害極大.因此,研究人員一直在探索降低動(dòng)物體脂的有效方法.其中研制和應(yīng)用抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體是一個(gè)重要手段.可以解決藥物殘留問(wèn)題,有益于人類(lèi)健康.該研究的獲取抗豬脂肪細(xì)胞膜抗體的輕、重鏈基因,構(gòu)建單鏈抗體基因,利用噬菌體展示技術(shù)制備噬菌體抗體,并在大

2、腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá),獲得具有對(duì)豬脂肪細(xì)胞結(jié)合活性的表達(dá)產(chǎn)物,為以后的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ).該研究采用一種新的免疫方法-刪減免疫法免疫動(dòng)物,從經(jīng)豬脂肪細(xì)胞免疫的小鼠脾臟中提取mRNA,以此為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈,以小鼠抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL特異性引物RT-PCR擴(kuò)增VH、VL基因片段,經(jīng)重疊引物延伸PCR (SOE-PCR)把VH與VL用編碼(Gly4Ser)3連接肽序列的Linker連接成單鏈抗體ScFv基因,克隆入

3、噬菌粒pCANTAB5E載體,并轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,在SOBAG平板上篩選轉(zhuǎn)化子,并用M13KO7超感染,獲得了抗豬脂肪細(xì)胞膜噬菌體抗體文庫(kù).經(jīng)豬脂肪細(xì)胞進(jìn)行三輪淘選后,ELISA篩選檢測(cè)、酶切鑒定富集后克隆,得到陽(yáng)性重組噬菌體抗體克隆.用陽(yáng)性重組噬菌體抗體,感染不含琥珀抑制基因的E.coli HB2151,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得了可溶性表達(dá)的抗豬脂肪細(xì)胞膜單鏈抗體.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ELISA鑒定表明其具有與豬脂肪細(xì)胞結(jié)合的活性

4、和特異性.SDS-PAGE檢測(cè)在約30KDa處有一新生條帶形成,與預(yù)期大小相符.用未經(jīng)免疫的多種小鼠的脾細(xì)胞作為基因來(lái)源,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈,以合成的小鼠重、輕可變區(qū)基因VH、VL引物,RT-PCR擴(kuò)增其天然抗體的重鏈基因VH和輕鏈基因VL,用含有15肽的Linker引物,對(duì)VL基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增修飾后,然后與VH基因通過(guò)重疊延伸拼接反應(yīng)(SOE-PCR),組裝成單鏈抗體基因(ScFv),克隆入噬菌粒pCANTAB5E載

5、體,并轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞,在SOBAG平板上篩選轉(zhuǎn)化子,并用M13KO7超感染,構(gòu)建了天然鼠源噬菌體抗體庫(kù).經(jīng)豬脂肪細(xì)胞和豬IgG篩選,獲得了抗豬脂肪細(xì)胞膜ScFv和抗豬IgG ScFv.天然鼠源噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建為篩選和制備各種抗體提供了一個(gè)平臺(tái).豬脂肪細(xì)胞膜重組噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建,為進(jìn)一步篩選具有高親和力、高特異性的基因工程抗體打下了良好的基礎(chǔ).抗豬脂肪細(xì)胞膜基因工程抗體的研究,為進(jìn)一步分離和發(fā)現(xiàn)這些抗體所識(shí)別的豬脂