抗CD45人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定.pdf

1、研究背景：急性髓系白血病(AML)是一種常見的惡性血液系統(tǒng)疾病,雖然化放療和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的應(yīng)用提高了患者的生存率,但仍有60％～70％遭受該疾病痛苦的病人死于AML。放化療后的造血干細(xì)胞移植只是為許多耐藥白血病類型病人提供了一種治愈的機(jī)會(huì),盡管有許多研究團(tuán)隊(duì)已證明了這種治療方法的有效、安全和可行性。研究證明針對(duì)白血病前體細(xì)胞和骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行靶向放療最安全的方法就是用放射物標(biāo)記的抗體直接靶向白血病細(xì)胞或正常骨髓造血干細(xì)胞。用單克

2、隆抗體治療急性髓性白血病早已有所報(bào)道,常用的抗體靶向標(biāo)志有CD33、CD66和CD45,而現(xiàn)行研究認(rèn)為抗CD45的抗體是最具研發(fā)前景的。
　　 CD45抗原是一種穩(wěn)定、高表達(dá)于所有白細(xì)胞和他們的前體細(xì)胞以及超過70％的骨髓有核細(xì)胞表面上的單鏈細(xì)胞膜糖蛋白,CD45又被稱為GP180、T200或白細(xì)胞共同抗原(LCA),是一種分子量約為200 kDa的酪氨酸磷酸酶,它穩(wěn)定表達(dá)于除成熟紅細(xì)胞和血小板外的所有造血細(xì)胞,且不存在于非造血

3、組織中,使之成為治療白血病的一個(gè)誘人的靶點(diǎn)。
　　 CD45能廣泛的表達(dá)于幾乎所有的白細(xì)胞,包括骨髓的髓系前體細(xì)胞和淋巴結(jié)中的成熟淋巴細(xì)胞以及90％的AML細(xì)胞,這些細(xì)胞和組織為病人治療的緩解或復(fù)發(fā)提供了大量抗體結(jié)合位點(diǎn)。由于CD45作為白細(xì)胞的標(biāo)記物能出現(xiàn)在正常和惡性細(xì)胞,所以在病人體內(nèi)應(yīng)用抗CD45抗體可以通過代謝分布到骨髓、脾臟和淋巴結(jié)中與靶抗原結(jié)合,用于治療急性白血病。
　　 在放射免疫治療中,通常的做法是有選擇

4、地針對(duì)一個(gè)特定的抗原將放射性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞。由于造血組織來源的細(xì)胞對(duì)放射線敏感和其上的靶抗原的高度可接近性,對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的放免治療一直被認(rèn)為是最成功的。在AML和MDS的放免治療中,CD45抗原由于具有高表達(dá)和特異結(jié)合性而成為極具吸引力的靶向目標(biāo)。放射性標(biāo)記的抗CD45抗體可將輻射物質(zhì)運(yùn)輸?shù)娇乖栃约?xì)胞和周邊環(huán)繞的抗原陰性細(xì)胞上。因此,放射免疫偶聯(lián)物不需要以高濃度綁定到每一個(gè)白血病細(xì)胞上或滲入骨髓或腫瘤細(xì)胞中引發(fā)致死性的DNA損傷

5、。在復(fù)發(fā)的白血病病人的放免治療中,即使腫瘤細(xì)胞不表達(dá)CD45抗原,也會(huì)由于圍繞其周圍的高表達(dá)CD45抗原的非惡性造血細(xì)胞所介導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)而被殺滅。在造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域,CD45抗原的這些特性,能促進(jìn)研究者針對(duì)它的放射性標(biāo)記的系列抗體進(jìn)行更加深入的研究,以便用于臨床的治療。
　　 隨著CD45分子異構(gòu)體的研究、流式細(xì)胞儀免疫分型的應(yīng)用及抗CD45單抗的靶向治療研究等深入發(fā)展,CD45分子在免疫學(xué)和血液學(xué)方面的應(yīng)用研究受到進(jìn)一步的

6、關(guān)注。可以預(yù)期,CD45必將會(huì)在臨床相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)后等方面發(fā)揮更大的作用。然而抗CD45單克隆抗體來源于小鼠,用于人體可誘導(dǎo)抗鼠抗體的產(chǎn)生。因此進(jìn)行基因工程改造抗體具有重要實(shí)踐意義。我們實(shí)驗(yàn)組已報(bào)道過了抗CD45單抗在AML治療中良好前景,由于治療中藥物仍存在毒性使我們一直致力于不斷的改進(jìn)。
　　 鼠標(biāo)源性全分子抗體由于具有高度免疫原性和巨大分子量在臨床治療應(yīng)用局限很多,而且長(zhǎng)期使用鼠單抗能誘發(fā)人抗鼠抗體(HAMA)的

7、反應(yīng)導(dǎo)致過敏性反應(yīng)和損傷對(duì)人體健康造成危害。為了減少親本鼠單抗的免疫原性,提高抗體在體內(nèi)增強(qiáng)免疫機(jī)制的能力,我們?cè)O(shè)想改造其成為人-鼠嵌合的基因工程抗體。我們用人源抗體的恒定區(qū)去取代親本鼠單抗的C區(qū),由于嵌合抗體中的C區(qū)為人源性的,所以該人-鼠嵌合抗體在保留了鼠單抗特異性的同時(shí),又降低了鼠抗體對(duì)人體的免疫原性；而且還具有比小鼠抗體更強(qiáng)的介導(dǎo)補(bǔ)體和細(xì)胞對(duì)靶抗原的殺傷和吞噬作用。此外,在構(gòu)建嵌合抗體時(shí),我們有目的地選擇了抗體的類型,使之能更有

8、效的發(fā)揮抗體的效用。我們將該單抗的可變區(qū)基因插入到含人恒定區(qū)的嵌合抗體專用表達(dá)載體pFUSE-CHIg和pFUSE2-CLIg,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)、純化嵌合抗體。
　　 現(xiàn)在我們首次研究并報(bào)導(dǎo)這種新型抗CD45的鼠/人嵌合抗體(命名Chi-CD45),目前國(guó)內(nèi)外尚無將CD45單抗進(jìn)行人源化改造的相關(guān)報(bào)道。體外試驗(yàn)研究證明,抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果隨著單克隆抗體濃度的改變發(fā)生梯度變化。而補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用發(fā)揮了嵌合抗體恒定區(qū)的功

9、能,它能通過增加嵌合抗體的濃度而抑制Jurkat/人PBMC增殖。
　　 本課題利用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗CD45單抗的輕鏈與重鏈基因,并插入pGEM-T載體中,將陽性克隆進(jìn)行核苷酸序列分析,目的是獲得正確地基因,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：構(gòu)建抗CD45嵌合抗體的真核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：通過PCR技術(shù)分別擴(kuò)增抗CD45單克隆抗體的輕鏈與重鏈可變區(qū)基因片段；利用DNAtools,IM

10、GT/QUEST及EBI TOOLS:ClustalW2分析軟件對(duì)輕鏈和重鏈基因分別進(jìn)行同源性比較。將經(jīng)過測(cè)序確認(rèn)的基因序列分別構(gòu)建入嵌合抗體的表達(dá)載體中轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,通過Western blotting檢測(cè)嵌合抗體的表達(dá)。對(duì)該嵌合抗體進(jìn)行分子建模,模擬其蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu),并通過相關(guān)效應(yīng)檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因工程抗體四級(jí)結(jié)構(gòu)的完整和功能的有效性。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清后,通過Protein A親和層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化；通過FACS檢測(cè)純

11、化后的嵌合抗體與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的能力；與親本單抗的競(jìng)爭(zhēng)抑制活性；在補(bǔ)體存在條件下的嵌合抗體Fc段介導(dǎo)的CDC效應(yīng)能力,以及嵌合抗體抑制靶細(xì)胞增殖的活力。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出的VL、VH基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定,其片段大小與理論值相符,DNA測(cè)序鑒定顯示其序列正確。經(jīng)分析軟件鑒定功能性輕鏈結(jié)構(gòu)域:從第16位堿基(ATG)開始,其后為57個(gè)bp的信號(hào)肽序列,編碼19個(gè)氨基酸；可變區(qū)全長(zhǎng)為333個(gè)堿基,抗CD45單抗有

12、功能的輕鏈均屬于IG к V1-117’01家族,V區(qū)匹配率為99.32％,J區(qū)為100％。
　　 重鏈結(jié)構(gòu)域分析:從第16位堿基(ATG)開始,其后為57個(gè)bp的信號(hào)肽序列,編碼19個(gè)氨基酸；可變區(qū)全長(zhǎng)為348個(gè)堿基,功能性重鏈屬于IGHV2-9-1’01家族。V區(qū)匹配率為96.84％,J區(qū)為87.23％。
　　 重組嵌合抗體的表達(dá)載體分別通過特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定顯示其產(chǎn)物片段大小與理論值相符,DNA測(cè)序鑒定顯示

13、其序列和閱讀框正確。共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞經(jīng)篩選后顯示嵌合抗體表達(dá)量低,后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。重組抗體產(chǎn)量低是制備基因工程抗體最大的障礙,高表達(dá)細(xì)胞株相對(duì)于整個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞群是非常稀少的,在穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)量可形成梯度下降,過度生長(zhǎng)的非表達(dá)細(xì)胞亦可使整個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞產(chǎn)量下降更明顯,甚至形成非表達(dá)細(xì)胞群。
　　 大多數(shù)細(xì)胞系產(chǎn)生的IgG可合成更多的輕鏈基因,在對(duì)人鼠嵌合抗體雜交細(xì)胞系研究中,發(fā)現(xiàn)輕鏈分泌的比率和細(xì)胞內(nèi)的輕鏈含量存在相關(guān)性,它合成的速度

14、比重鏈要快幾倍,而且需要的量更多。有文獻(xiàn)報(bào)道分步轉(zhuǎn)染的方法,可以使表達(dá)有功能的細(xì)胞增加5～30％,先用高濃度抗生素穩(wěn)轉(zhuǎn)輕鏈基因待該細(xì)胞穩(wěn)定后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)染重鏈基因。在后續(xù)培養(yǎng)過程適量減少培養(yǎng)基用量,延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間達(dá)7～10天以上均能相對(duì)提高抗體濃度,或選用DMSO,丁酸鈉等在能抑制細(xì)胞增長(zhǎng)同時(shí),促進(jìn)抗體分泌尤其對(duì)CHO細(xì)胞重組蛋白質(zhì)有促進(jìn)效果(產(chǎn)量提高約2倍)。
　　 參考相關(guān)文獻(xiàn)后我們采用了分步轉(zhuǎn)染的方法并用丁酸鈉間隔刺激

15、轉(zhuǎn)染細(xì)胞,ELISA結(jié)果顯示嵌合抗體產(chǎn)量有極大提高；分子模擬的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)顯示了構(gòu)建的抗CD45人-鼠嵌合抗體符合完整有功能的基因工程抗體,Insight Ⅱ軟件模擬了抗CD45抗體的Fab段結(jié)構(gòu)域,該建模模型表明該抗體具有完整的抗原結(jié)合凹槽能穩(wěn)定的發(fā)揮抗體的相關(guān)功能。
　　 轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)證實(shí)表達(dá)成功以后,部分轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞放入液氮中凍存,5個(gè)月后取出凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),先后經(jīng)過一次常規(guī)有限稀釋克隆和多次ELISA方法鑒定,證明

16、該轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞經(jīng)過液氮凍存及多次傳代,仍能夠保持良好的體外生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 Western blotting結(jié)果顯示培養(yǎng)3天的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞分泌的上清中有嵌合抗體表達(dá)。收集培養(yǎng)的上清經(jīng)Protein A親和層析純化后,SDS-PAGE鑒定顯示在純化產(chǎn)物中僅見嵌合抗體重鏈和輕鏈條帶,其分子量大小與理論值相符。FCM檢測(cè)顯示純化后的嵌合抗體分子的V區(qū)能夠與多株腫瘤細(xì)胞及人PBMC細(xì)胞表面CD45抗原特異性的結(jié)合,且其結(jié)合能力與相同濃度的鼠