MiR-182靶向基因Rac1調(diào)控糖尿病心肌病變的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:探討Rac1參與調(diào)控糖尿病心肌病變的上游機(jī)制,揭示miRNA在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用,為糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制及臨床治療的研究提供新視角。
  方法:第一部分利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)調(diào)控 Rac1的候選 miRNAs。在糖尿病組db/db小鼠及對(duì)照組db/m小鼠的心肌組織中驗(yàn)證所有候選miRN As的表達(dá);并將糖尿病組小鼠心肌中差異表達(dá)的miRNAs與Rac1進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,篩選出與Rac1呈最強(qiáng)負(fù)相關(guān)的mi

2、RNA。
  第二部分原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,通過(guò)高糖處理心肌細(xì)胞,用real-time RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證Rac1、所選 miRNA的表達(dá)情況。通過(guò)轉(zhuǎn)染所選 miRNA的模擬物進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)分為4組:正常糖組(5mM),高糖組(33 mM),正常糖+所選miRNA模擬物組,高糖+所選miRNA模擬物組。通過(guò)real-time RT-PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)分別檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Rac1、β-MHC、α-SMA

3、的mRNA及蛋白表達(dá)情況。
  第三部分8周齡雄性C57/BL-6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=5),miR-182模擬物對(duì)照組(n=5),STZ型糖尿病組(n=15),STZ型糖尿病+所選miRNA模擬物治療組(n=15)。向C57/BL-6J小鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(S TZ)建立STZ型糖尿病動(dòng)物模型。8周后實(shí)驗(yàn)達(dá)終點(diǎn)時(shí),記錄小鼠的體重及血糖情況;采用小動(dòng)物用高分辨超聲儀檢測(cè)各組小鼠心臟功能;通過(guò) HE染色觀察心肌細(xì)胞大

4、小,通過(guò)Masson染色觀察心肌纖維化程度;運(yùn)用透射電鏡觀察小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu);利用real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心肌組織β-肌球蛋白重鏈(β-MHC),α-肌球蛋白重鏈(α-MHC),心房鈉尿肽(ANP),I型膠原(Col I)和III型膠原(Col III) mRNA,待測(cè)mRNA及Rac1的表達(dá)情況。
  結(jié)果:第一部分通過(guò)生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)到參與調(diào)控Rac1的候選miRNAs共6個(gè):分別是miR-182、m

5、iR-142-3p、miR-140、miR-101a、miR-429、miR-200b。與db/m組比較,db/db組糖尿病小鼠心肌組織中miR-142-3p、miR-182的表達(dá)顯著下調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Pearso n相關(guān)性分析顯示miR-182與Rac1表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)最顯著,r值為-0.89102。
  第二部分體外實(shí)驗(yàn)顯示高糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大時(shí),miR-182表達(dá)明顯降低,而Rac1表達(dá)明顯升高,兩者

6、之間亦呈負(fù)相關(guān)。與正常糖組比較,高糖組心肌細(xì)胞肥大明顯。與高糖組相比,高糖+miR-182模擬物組心肌細(xì)胞肥大程度明顯降低。RT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示與高糖組相比,高糖+miR-182模擬物組心肌細(xì)胞Rac1及β-MHC的表達(dá)均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但α-SMA的表達(dá)降低不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  第三部分超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示:與糖尿病組相比,糖尿病+miR-182模擬物組小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)及左室短

7、軸縮短率明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:與糖尿病組比較,糖尿病+miR-182模擬物組小鼠心肌組織中Rac1、ANP、Col I、Col III mRNA的表達(dá)及β/α-MHC比值明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
  HE染色結(jié)果顯示:正常對(duì)照組及miR-182模擬物對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則整齊,細(xì)胞核大小均一;而糖尿病組小鼠心肌排列紊亂,心肌肥大明顯,細(xì)胞核增大,形態(tài)不規(guī)則;糖尿病+miR

8、-182組小鼠心肌肥大程度減低,心肌排列較規(guī)則。Masso n染色后心肌纖維呈現(xiàn)為深紅色而心臟間質(zhì)膠原呈現(xiàn)為深藍(lán)色:正常對(duì)照組及 miR-182模擬物對(duì)照組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較少且均勻分布;而糖尿病組小鼠心肌組織膠原纖維明顯增多聚集,分布紊亂不均勻;糖尿病+miR-182組小鼠心肌膠原纖維較糖尿病組明顯減少。
  透射電鏡結(jié)果顯示:正常對(duì)照組及 miR-182模擬物對(duì)照組小鼠心肌纖維排列整齊有序,肌小節(jié)及明帶暗帶清晰可見(jiàn),線粒體

9、大小均一,呈圓形或橢圓形沿心肌纖維整齊排列;糖尿病組小鼠心肌纖維排列紊亂,肌絲扭曲、斷裂,心肌線粒體明顯異型增大及增多聚集,線粒體可腫脹、嵴消失甚至溶解,可見(jiàn)糖原顆粒及脂滴增多聚集,心臟間質(zhì)大量膠原纖維聚集,可見(jiàn)較多自噬體;而糖尿病+miR-182模擬物組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷較糖尿病組明顯減輕。
  結(jié)論:(1)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)、通過(guò)動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及Pearso n相關(guān)性分析,最終篩選得出Rac1的候選miRNA為 mi

10、R-182;同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證心肌細(xì)胞中miR-182與Rac1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
 ?。?)M iR-182模擬物降低高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Rac1的表達(dá),減輕高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大程度,降低心肌細(xì)胞肥大相關(guān)表型的表達(dá)。
  (3)MiR-182可參與糖尿病心肌病的調(diào)控,miR-182模擬物能可減輕糖尿病小鼠心肌組織Rac1表達(dá),改善糖尿病小鼠心臟收縮功能,這與其降低糖尿病小鼠心肌肥大及心肌纖維化程度,減輕糖尿病小鼠心肌超微結(jié)

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