microRNA-30c通過調(diào)節(jié)自噬參與調(diào)控糖尿病心肌病機制的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　糖尿病(diabetesmillitus,DM)是當(dāng)今威脅人類健康的重大疾病。研究指出,現(xiàn)在全世界現(xiàn)有糖尿病患者2.85億,預(yù)計到2030年,糖尿病的患病人數(shù)將幾乎是現(xiàn)在的兩倍。心血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘或致死的首要原因。其中,糖尿病獨立于高血壓、心臟瓣膜疾病、冠心病和及其他心臟病所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,即糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy)越來越受到研究者重視。研究者們相繼發(fā)現(xiàn)

2、脂質(zhì)毒性(lipotoxicity)、糖毒性、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、氧化應(yīng)激增強、代謝底物轉(zhuǎn)變、線粒體功能失常、炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERstress)等都是參與2型糖尿病心肌病的致病機制。其中脂質(zhì)毒性對心臟功能和結(jié)構(gòu)的損傷是糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但確切的分子機制還不甚明了。最近有研究指出,microRNA和自噬都參與胰島素抵抗時心臟病變過程,為我們對糖尿病心肌病的分子機制研究提

3、供了新的視角。
　　微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類廣泛存在于生物體內(nèi),22-23個堿基長度的非編碼單鏈RNA。MiRNAs通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregion,3’UTR)特異性結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。大量的研究表明miRNAs參與機體的各種生命進程;同時,miRNAs功能異常參與各種疾病過程。近年來的研究表明,miRNAs,尤其是心臟高豐度表達的miRNA

4、s,在各種心臟病發(fā)病機制中扮演著重要作用。研究人員通過在心肌細胞過表達這些miRNAs,導(dǎo)致心肌細胞發(fā)生肥大或體積減小,揭示了miRNA在心肌肥厚、心室重構(gòu)等病理生理過程中起著關(guān)鍵作用。然而miRNAs在糖尿病及其心血管并發(fā)癥中的作用還不是很明確。
　　自噬是一種對細胞內(nèi)成分降解再利用的保守進化過程,通過對細胞內(nèi)長壽命蛋白或損傷蛋白及細胞器的降解,自噬維持著細胞生存。正常情況下,心臟低水平自噬是一種細胞應(yīng)激的保護機制;然而,自噬過

5、度也會導(dǎo)致細胞損傷。最近有研究指出,在果糖誘導(dǎo)胰島素抵抗的小鼠模型中,自噬的激活與心肌細胞過氧化產(chǎn)物增多、纖維化及細胞死亡有關(guān),從而參與形成心臟胰島素抵抗,提示自噬在糖尿病心肌病致病機制中扮演重要角色。此外最近關(guān)于miR-30a參與調(diào)控自噬的研究引起廣泛關(guān)注,說明miRNAs在自噬的調(diào)控中起著重要作用。
　　MiR-30家族是在心肌細胞高豐度表達的miRNAs之一。過去實驗證明,miR-30參與調(diào)節(jié)心肌肥大、心室重塑、心肌纖維化等

6、一系列心臟功能異常的致病過程。但是miR-30c在糖尿病時心臟中的作用還不清楚。此外最近關(guān)于miR-30a參與調(diào)控自噬的研究引起廣泛關(guān)注,說明miRNAs在自噬的調(diào)控中起著重要作用。miR-30c、自噬及糖尿病心肌病之間的調(diào)節(jié)關(guān)系啟發(fā)我們探究:miR-30c是否參與了2型糖尿病的病理過程?如果參與,miR-30c是否是通過調(diào)節(jié)自噬參與了糖尿病心肌病致病過程?因此,我們圍繞假設(shè),展開相關(guān)研究,試圖從miRNAs的角度尋找新的糖尿病心肌病的

7、發(fā)病機制和治療方案。
　　實驗方法:
　　運用real-timePCR對2型糖尿病db/db小鼠心肌和正常對照C57BL/Ks小鼠心肌分別進行檢測,從中了解miR-30c是否存在差異型表達。
　　利用western-blot技術(shù),在蛋白水平檢測自噬強度在db/db小鼠心肌中相對于正常對照C57BL/Ks小鼠心肌是否有所改變。
　　用高濃度FFAs培養(yǎng)H9c2心肌細胞,在細胞實驗中檢測miR-30c及自噬發(fā)生受FF

8、As調(diào)控。
　　利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-30c的作用靶點,將挑選出的預(yù)測的靶mRNA的3’UTR區(qū)克隆至pMIR-Report載體,運用熒光報告基因技術(shù)驗證靶點,并利用western-blot技術(shù)再次驗證靶點。
　　利用我們特有的心肌特異性病毒表達載體recombinantadeno-associatedvirusvector9(rAAV9),將miR-30c、anti-miR-30c及靶mRNA分別包裝至病毒表達載體

9、,并檢測滴度及轉(zhuǎn)染效率。
　　將上述rAAV載體介導(dǎo)體內(nèi)表達,在db/db小鼠心肌中差異性表達miR-30c,并將靶mRNA回復(fù),驗證miR-30c的載體沉默效應(yīng)。
　　通過小鼠心臟超聲和血流動力學(xué)分析檢測差異表達miR-30c是否影響小鼠心臟功能同時western-blot和電鏡檢測差異表達miR-30c對自噬通路的影響。
　　利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-30c啟動子區(qū)的上游調(diào)控靶點,miR-30c的5’-prom

10、oter區(qū)克隆至pGL3-Report載體,運用熒光報告基因技術(shù)驗證靶點,并利用western-blot技術(shù)再次驗證上游調(diào)控。
　　實驗結(jié)果:
　　1.2型糖尿病小鼠心肌組織中差異性表達miR-30c通過real-timePCR檢測證實了miR-30c的差異性表達。驗證相對于正常對照,在2型糖尿病心肌病中miR-30c表達下調(diào)。
　　2.2型糖尿病小鼠心肌組織中自噬增強利用western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白Bec

11、lin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達,證明相對于正常對照,2型糖尿病小鼠心肌中自噬增強。
　　3.高濃度FFAs培養(yǎng)H9c2心肌細胞miR-30c下調(diào)、自噬發(fā)生增強高水平FFAs培養(yǎng)心肌細胞H9c2,相對于未處理對照組,real-timePCR檢測表明miR-30c明顯下調(diào);western-blot證明FFAs誘導(dǎo)自噬增強
　　4.miR-30c靶點預(yù)測及驗證利用TARGETSCAN預(yù)測分析網(wǎng)站對miR-30c的作用靶mRNAs進

12、行預(yù)測分析,篩選出Beclin-1是miR-30c可能的靶點mRNA,將其3’UTR區(qū)序列構(gòu)建至pMIR-Report載體,通過熒光報告基因技術(shù)結(jié)果提示Belcin-1為miR-30c的作用靶基因,同時采用western-blot進行了蛋白水平驗證。
　　5.rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c及rAAV-Beclin-1病毒包裝及rAAV載體介導(dǎo)miR-30c體內(nèi)差異性表達及其對2型糖尿病心臟功能調(diào)節(jié)分析

13、及對自噬的影響
　　采用rAAV9包裝系統(tǒng),分別包裝rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c及rAAV-Beclin-1病毒,real-timePCR檢測病毒滴度,同時轉(zhuǎn)染rAAV-GFP檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　將db/db小鼠尾靜脈分別注射rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c,使miR-30c在心肌中差異性表達。并另外注射rAAV-Beclin-1病毒逆轉(zhuǎn)過表達miR-30c對Bec

14、lin-1的抑制效應(yīng)。小鼠心臟超聲和血流動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),相對于對照組,rAAV-miR-30c組心功能增強。Western-blot發(fā)現(xiàn)過表達miR-30c使Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白水平降低,提示自噬降低,并通過電鏡進一步驗證過表達rAAV-miR-30c使自噬小體減少。但rAAV-Beclin-1回復(fù)后,逆轉(zhuǎn)了miR-30c的效應(yīng),自噬減弱。同時,rAAV-anti-miR-30c組心功能受損,自噬增強。
　　6.MiR

15、-30c上游表達調(diào)控利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測出NF-κB調(diào)控miR-30c啟動子區(qū),miR-30c的5’-promoter區(qū)克隆至pGL3-Report載體,運用報告基因技術(shù)驗證NF-κB對miR-30c啟動子區(qū)的調(diào)控,并利用real-timePCR檢測再次驗證NF-κB上游調(diào)控miR-30c表達。
　　7.db/db小鼠心臟中NF-κB表達研究通過對db/db小鼠心臟組織的免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)NF-κB表達降低;同時其抑制分子IκB

16、-α表達增強。
　　結(jié)論:
　　本實驗通過檢測2型糖尿病心肌病動物模型db/db小鼠心肌組織中的差異性表達miR-30c,利用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù),對miR-30c在體內(nèi)、體外對糖尿病時心肌細胞的作用及其機制進行了研究,得出以下結(jié)論:
　　1.2型糖尿病小鼠db/db心肌細胞中或高濃度FFAs誘導(dǎo)心肌細胞時,miR-30c表達下調(diào),自噬增強;
　　2.miR-30c能通過沉默Beclin-1