Inpp5f在糖尿病心肌病變中的作用及其機制研究.pdf

1、糖尿病嚴重威脅人類健康。近些年，糖尿病的患病率大幅度上升，并且在未來的25年里將成為世界上引起致殘和致死的主要的因素之一。糖尿病心肌病表現(xiàn)為心室功能障礙，與冠狀動脈和高血壓無關(guān)，是糖尿病患者發(fā)病率和死亡率的首要原因，但是糖尿病心肌病的具體發(fā)病機制還不清楚。
　　胰島素缺乏的1型糖尿病和胰島素抵抗的2型糖尿病與代謝性應激（主要是高血壓和高血脂）一起是公認的糖尿病心肌病發(fā)病的危險因素。這些危險因素共同作用可降低葡萄糖攝取，促進脂肪酸的

2、攝取和氧化。這種代謝方式的轉(zhuǎn)變在心肌病的形成中發(fā)揮著重要的作用，但具體的分子機制并不十分清楚。胰島素/PI3K/Akt信號通路在整個分子事件中發(fā)揮重要的作用。因此，研究胰島素/PI3K/Akt信號通路在糖尿病中是如何調(diào)整信號轉(zhuǎn)錄方式以及如何發(fā)生異常顯得至關(guān)重要。
　　Inpp5f（Inositol polyphosphate-5-phosphatase F）編碼全長為1132aa的蛋白，該蛋白含有一個352aa的 SAC磷酸酶結(jié)構(gòu)

3、域。Inpp5f是一種肌醇磷酸酶，主要在心、腦、腎表達。近期研究發(fā)現(xiàn)Inpp5f是Akt信號的負調(diào)控因子，但是該分子在糖尿病心臟中的表達和功能還不清楚。因此，本課題旨在探討 Inpp5f在糖尿病心肌病中的作用以及具體的分子機制。
　　目的：
　　1）在糖尿病動物模型中查看Inpp5f的表達變化，分析糖尿病相關(guān)因素（胰島素、高糖和高脂）與Inpp5f表達的相關(guān)性；
　　2）心臟病理和超聲心動圖評價動物心臟功能，分析Inp

4、p5f表達與糖尿病小鼠心肌病變的相關(guān)性；
　　3）分析糖尿病心肌病變中Inpp5f表達變化的原因：代謝應激（胰島素、高糖和高脂）對Inpp5f表達的影響；
　　4）探討胰島素、高糖和高脂等代謝應激影響Inpp5f表達的深層次分子機制；
　　5）探討Inpp5f的表達異常是否影響心肌細胞的胰島素信號和生理功能。
　　方法和結(jié)果：
　　1）通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立1型糖尿病模型，通過高脂飲食（

5、HFD）誘導的方法建立2型糖尿病模型；qRT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示糖尿病小鼠心臟組織中Inpp5f的表達升高；統(tǒng)計學結(jié)果表明胰島素，血糖，膽固醇和甘油三酯的水平與Inpp5f的表達具有相關(guān)性。
　　2）超聲和組織學結(jié)果顯示糖尿病小鼠的心臟發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，包括心臟增大，射血分數(shù)值（EF）降低，左室等容舒張時間（IVRT）延長；統(tǒng)計學分析結(jié)果表明Inpp5f的表達與EF值呈負相關(guān)，與IVRT呈正相關(guān)。
　　

6、3)在H9C2心肌細胞中，使用胰島素、高糖或游離脂肪酸刺激，qRT-PCR和Westernblot檢測Inpp5f的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素，高糖和脂肪酸均能增加H9C2中Inpp5f的表達。
　　4）Westernblot結(jié)果顯示胰島素使心肌細胞Sp1的表達升高；而高糖和游離脂肪酸處理使心肌細胞NF-κB信號活化；qRT-PCR和Westernblot結(jié)果表明Sp1抑制劑能降低胰島素對Inpp5f的表達促進作用，而NF-κB的抑制劑

7、能降低高糖和游離脂肪酸引起的Inpp5f表達升高。
　　5）雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示胰島素，高糖和游離脂肪酸使Inpp5f的啟動子活性升高，而Sp1和NF-κB的抑制劑降低了代謝應激引起的Inpp5f啟動子活性升高；免疫共沉淀（ChIP）結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子Sp1和NF-κB能夠和Inpp5f的啟動子結(jié)合；
　　6）Westernblot結(jié)果顯示腺病毒介導的Inpp5f的過表達能降低心肌細胞Akt磷酸化水平，而干涉Inpp5f

8、的表達則導致Akt磷酸化水平升高；高糖和游離脂肪酸能降低心肌細胞內(nèi)Akt的磷酸化水平，但干涉Inpp5f的表達能逆轉(zhuǎn)上述變化；利用流式細胞術(shù)探討細胞葡萄糖攝取的實驗中發(fā)現(xiàn)，干涉Inpp5f能促進心肌細胞對葡萄糖的攝取。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)現(xiàn)一個新的磷酸酶Inpp5f在糖尿病心肌病變中扮演了重要角色。Inpp5f在糖尿病心肌病變的失代償期表達升高，其表達量與心臟功能有顯著的相關(guān)性；在分析Inpp5f表達升高原因時發(fā)現(xiàn)，胰島

9、素、高糖和高脂因素均能導致其表達增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)，胰島素通過活化Sp1轉(zhuǎn)錄因子，而高糖和高脂則通過活化NF-κB信號轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Inpp5f的表達；Inpp5f能抑制心肌細胞Akt的磷酸化以及心肌細胞對葡萄糖的攝取。
　　綜合這些結(jié)果，我們提出了一個糖尿病心臟損傷過程中的分子調(diào)節(jié)環(huán)路，即正常情況下，胰島素通過活化PI3K/Akt促進心肌細胞葡萄糖的攝取，與此同時通過轉(zhuǎn)錄機制誘導負性調(diào)控分子Inpp5f的表達，控制PI3K/Akt的

10、活性，獲得信號調(diào)節(jié)的平衡。糖尿病病變早期，胰島素減少或抵抗導致PI3K/Akt的活性降低，此時，負性調(diào)節(jié)因子Inpp5f的表達同樣降低，心肌細胞處于代償期。隨著糖尿病不斷進展，高糖/高脂因素積累后誘發(fā)持續(xù)的微炎癥狀態(tài)，NF-κB信號活化。NF-κB信號通過轉(zhuǎn)錄機制促進Inpp5f的表達，表達升高的Inpp5f進一步抑制PI3K/Akt，因而加重心臟損傷。
　　我們提出了一個新的胰島素、高糖、高脂因素影響Inpp5f/PI3K/Ak