底物捕獲法檢測SHP1在MAPK信號通路中的靶蛋白.pdf

1、SHP1是一種胞質蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase，PTP)，主要表達于造血細胞和某些上皮細胞。其在造血細胞中的主要功能是抑制細胞生長、增殖及分化。但在某些上皮細胞或異常表達該基因的某些實體瘤細胞中，SHP1的功能尚不明確，一些研究表明SHP1正向調(diào)控EGF誘導MAPK信號通路的活化，促進相應細胞生長，但是并不清楚其具體作用機制。一個重要原因是在實體瘤細胞中并不了解SHP1參與調(diào)節(jié)MAPK信號通

2、路的作用底物。本研究旨在利用底物捕獲技術檢測SHP1在MAPK信號通路中的靶蛋白，并構建穩(wěn)定表達SHP1底物捕獲突變體的細胞株，為SHP1在MAPK信號通路中靶蛋白的進一步鑒定提供基礎。 一、底物捕獲法檢測SHP1在MAPK信號通路中的靶蛋白實驗中構建了SHP1CSDA-Flag、SHP1DAQA-Flag、SHPlTA-Flag的SHP1底物捕獲突變體，重組質粒轉染HEK293細胞，饑餓細胞16h后，EGF刺激細胞，細胞上清經(jīng)

3、Flag抗體免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳、轉印、磷酸化酪氨酸抗體免疫印跡檢測與SHP1及其突變體相互作用的信號蛋白。結果顯示EGF刺激后，在表達SHPlCSDA-Flag的HEK293細胞中，檢測到一約90KD大小酪氨酸磷酸化蛋白，而在表達野生型SHP1-Flag的HEK293細胞中則檢測不到這一蛋白，且在未經(jīng)EGF刺激的表達野生型或突變型SHP1-Flag的HEK293細胞中均未檢測到這-90KD酪氨酸磷酸化蛋白，說明此90KD蛋

4、白可能為SHP1參與EGF活化MAPK信號通路的靶蛋白之一。 二、穩(wěn)定表達S腫lCSDA-Flag細胞株的構建由于SHP1-Flag的CSDA雙突變體可以捕獲SHP1在MAPK信號通路中的90KD靶蛋白，但是利用一些相應大小的抗體卻未能鑒定這一蛋白，因此必須通過其他手段鑒定該蛋白。本研究利用：Invitrogen公司的Flp-InTM系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達SHPlCSDA-Flag的細胞株-Flp-In TM-293-SHP1CSD