MAPK信號(hào)通路在NO介導(dǎo)的脊髓繼發(fā)性損傷中的作用.pdf

1、急性外傷性脊髓損傷過程中往往伴有神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)源性膠質(zhì)細(xì)胞的活化，外周炎性細(xì)胞在損傷區(qū)局部的浸潤(rùn)，以及損傷區(qū)局部各種細(xì)胞因子、化學(xué)因子的合成。諸如此類的反應(yīng)在急性外傷性脊髓損傷的繼發(fā)性損害的病理機(jī)制中扮演著十分重要的角色。 一氧化氮(nitricoxide,NO)是脊髓損傷后的組織代謝產(chǎn)物之一，其合成有賴于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)的催化。NO在脊髓損傷

2、后病理發(fā)展過程中的作用越來越受到重視，對(duì)其合成、作用及清除的機(jī)制進(jìn)行深入研究，將有助于開拓臨床工作者治療脊髓損傷的思路，為減輕脊髓繼發(fā)性損傷，改善預(yù)后帶來新的希望。 NO以L-精氨酸為底物在NOS的催化下合成，半衰期極短，不易直接定量研究，故常以NOS活性來間接反映其生成情況。然而，有關(guān)NO還有許多空白有待研究者們?nèi)ヌ钛a(bǔ)。到目前為止，損傷后iNOS表達(dá)的確切機(jī)制尚未闡明，表現(xiàn)在對(duì)于脊髓損傷后損傷區(qū)附近iNOS表達(dá)的在體研究很少，

3、對(duì)于iNOS表達(dá)的時(shí)空規(guī)律的描述也有欠系統(tǒng)；其次，雖然關(guān)于iNOS與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系的研究已經(jīng)較為深入，但是有關(guān)其與神經(jīng)元變性、細(xì)胞壞死之間的關(guān)聯(lián)還鮮見報(bào)道；再則，對(duì)于脊髓損傷區(qū)MAPK通路的活化現(xiàn)象，大多數(shù)研究者都是著眼于將其與痛敏反應(yīng)的形成聯(lián)系在一起，對(duì)于MAPK在前炎性細(xì)胞因子生成中的作用研究?jī)H偶見，而其在iNOS生成中的作用研究則完全是空白；最后，還從未有將MAPK激酶的抑制劑作為工具藥在脊髓損傷后給予治療實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。

4、本論文以探索上述問題為出發(fā)點(diǎn)，以T10節(jié)段脊髓全橫斷的大鼠為研究對(duì)象，借助多種技術(shù)手段，對(duì)上述問題逐一進(jìn)行了研究。本研究分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)： 1.用免疫組織化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)記、Westernblot以及RT-PCR技術(shù)，觀察了SCI后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化、iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)變化和細(xì)胞定位； 2.利用NOS抑制劑L-NAME，觀察了NO對(duì)于神經(jīng)元凋亡、壞死的誘導(dǎo)作用； 3.用Westernblot和免疫

5、熒光雙標(biāo)記的方法觀察了MAPK家族中的P-ERK1/2、P-p38、P-JNK的在脊髓損傷后的時(shí)程變化趨勢(shì)以及P-ERK1/2、P-p38的細(xì)胞定位；并借助ERK1/2和p38的抑制劑在SCI前預(yù)處理觀察這些MAPK信號(hào)通路對(duì)于iNOS生成以及損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡、壞死的影響。 4.在SCI后30min和90min給予ERK1/2和p38的抑制劑，模擬臨床治療模式，觀察對(duì)iNOS生成以及損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡、壞死的影響。 本研究

6、的主要結(jié)果有： 1.脊髓全橫斷后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞早在傷后1h即發(fā)生活化。iNOS陽性細(xì)胞出現(xiàn)在傷后3h至24h的脊髓灰質(zhì)內(nèi)，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。iNOS的蛋白量在損傷后3h開始明顯上調(diào)，在6h達(dá)到高峰，到24h開始下降，直到72h才返回到基礎(chǔ)水平。iNOSmRNA水平亦在術(shù)后1h開始升高，在損傷后6h達(dá)到高峰，直到72h才返回到基礎(chǔ)水平。 2.脊髓全橫斷前給予NOS抑制劑L-NAME可以使脊髓全橫斷后24h時(shí)

7、的凋亡細(xì)胞百分比顯著性減少，同時(shí)使脊髓全橫斷后7d的NeuN染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量回升。 3.脊髓全橫斷誘導(dǎo)了損傷區(qū)附近組織內(nèi)P-ERK1/2和P-p38的表達(dá)上調(diào)，而P-JNK水平變化不明顯。脊髓全橫斷后6h的共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和p38的磷酸化現(xiàn)象見于脊髓損傷區(qū)附近灰質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞內(nèi)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP與這兩種激酶均不雙標(biāo)。脊髓全橫斷前30min給予PD98059和SB203580分別抑制了

8、ERK1/2和p38的活性，都可以使SCI后24h時(shí)的凋亡細(xì)胞百分比減少，SB203580的抑制效力更為顯著。同樣預(yù)處理觀察脊髓全橫斷后7d的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量回升情況的結(jié)果顯示，PD98059組與單純脊髓損傷組間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而SB203580組與單純脊髓損傷組相比差異顯著。 4.脊髓全橫斷后30min給予PD98059可一定程度下調(diào)iNOSmRNA水平，而90min組無此作用。而30min和90min給予的SB2035

9、80都能夠顯著地下調(diào)iNOSmRNA水平。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)給予的PD98059都不能減輕凋亡的發(fā)生和增加神經(jīng)元的存活；反之，同樣時(shí)間點(diǎn)給予的SB203580都能夠顯著地減少凋亡發(fā)生，增加神經(jīng)元的存活，其中30min給藥的效果優(yōu)于90min。 本研究的結(jié)論為： 1.大鼠脊髓全橫斷損傷后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是NO生成的主要來源； 2.由iNOS合成的NO是SCI過程中造成繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡壞死的重要因素； 3