L-periaxin蛋白分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域間的互作及對其功能的影響.pdf

1、軸周蛋白Periaxin是施旺氏細胞中特異性表達的支架蛋白之一，在髓鞘的形成與穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Periaxin基因的缺失或突變會引起脫髓鞘型腓骨肌萎縮癥(CMT)4F亞型的發(fā)生。由于mRNA不同的剪切方式，periaxin基因編碼了兩種長短不同的含PDZ結(jié)構(gòu)域的periaxin蛋白，即L-periaxin和S-periaxin。L-periaxin由N端到C端分別由PDZ結(jié)構(gòu)域、核定位信號（NLS）、重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（Repeat d

2、omain）、酸性結(jié)構(gòu)域（Acidic domain）四個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。而S-periaxin僅含有一個PDZ結(jié)構(gòu)域。
　　首先，對L-periaxin與S-periaxin之間的關(guān)系進行了探究。通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)L-periaxin與S-periaxin在RSC96細胞的細胞質(zhì)中的共定位。之后通過GST pull-down，免疫共沉淀以及雙分子熒光互補等實驗證明了二者之間存在相互作用。進而構(gòu)建各種截短型重組質(zhì)粒，證實了二者之間

3、的互作存在于二者N端的PDZ結(jié)構(gòu)域之間，通過各自的PDZ結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體。進一步通過雙分子熒光互補，結(jié)合流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，S-periaxin會抑制L-periaxin同源二聚體的形成。由此推測，S-periaxin可能是L-periaxin發(fā)揮功能的一個調(diào)節(jié)因子。
　　其次，還發(fā)現(xiàn)L-periaxin自身可以進行首尾互作，形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。構(gòu)建了L-periaxin的N端與C端各個結(jié)構(gòu)域的重組質(zhì)粒，通過GST pull-d

4、own，免疫共沉淀以及雙分子熒光互補等實驗，分別驗證各個結(jié)構(gòu)域之間的互作關(guān)系，最終發(fā)現(xiàn)L-periaxin N端的NLS結(jié)構(gòu)域與其C端的酸性結(jié)構(gòu)域之間存在明顯的相互作用，并且可引起退行性疾病的點突變E1259K會影響該相互作用。之后通過免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)該互作影響著L-periaxin在RSC96細胞中的定位，競爭性實驗驗證了該互作還受到DRP2蛋白的抑制。由此，推測出L-periaxin在RSC96細胞中的存在模式圖：當(dāng)L-periax