擴(kuò)展青霉脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)域突變對(duì)其活性影響的研究.pdf

1、為了便于對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶基因進(jìn)行分子設(shè)計(jì)及改造，本論文將擴(kuò)展青霉脂肪酶成熟肽編碼基因插入到pPIC9K表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-pel，并在脂肪酶基因5’端上游加上（His）6標(biāo)簽的編碼序列。通過比對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶與黑曲霉阿魏酸酯酶的氨基酸序列，選擇擴(kuò)展青霉脂肪酶“蓋子”左右側(cè)鉸鏈區(qū)的第66、81、94位氨基酸、整個(gè)“蓋子”以及“蓋子”右側(cè)鉸鏈區(qū)等五個(gè)部位作為突變位點(diǎn)，研究擴(kuò)展青霉脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)及其兩側(cè)鉸鏈區(qū)突變對(duì)脂

2、肪酶活性的影響。
　　 利用前面構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-pel作為模板，采用環(huán)狀質(zhì)粒一步PCR定點(diǎn)突變法對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶“蓋子”左右兩側(cè)鉸鏈區(qū)的三個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行突變（T66G、T81P、K94E），獲得含有突變氨基酸殘基編碼序列的重組表達(dá)質(zhì)粒，依次為：pPIC9K-pel-T66G、pPIC9K-pel-T81P、pPIC9K-pel-K94E。上述重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到畢赤酵母GS115營養(yǎng)缺陷型菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)

3、產(chǎn)物經(jīng)過Ni-柱親和純化后，測(cè)定其水解4-硝基苯癸月桂酸酯的比活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PELT66G重組脂肪酶的比活力與野生型PEL脂肪酶相近，為5.09 U/mg：而PELT81P和PEIK94E重組脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶分別提高了2.95倍和2.57倍，分別達(dá)到19.1U/mg和17.2 U/mg。
　　 其次采用引入酶切位點(diǎn)再環(huán)狀質(zhì)?；貜?fù)突變法置換了擴(kuò)展青霉脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)域（68ITDFVND175-71DTNLO

4、LDT78），并與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pPIC9K-pel（-lid）；該重組質(zhì)粒導(dǎo)入到畢赤酵母GS115營養(yǎng)缺陷型菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-柱純化后，SDS-PAGE電泳能檢測(cè)到一條約28 kDa的表達(dá)條帶。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)橄欖油羅丹明B平板定性檢測(cè)沒有酶活。
　　 最后通過重疊延伸PCR置換了擴(kuò)展青霉脂肪酶的“蓋子”右側(cè)鉸鏈區(qū)（76DIA78-79NYT81），突變體插入到載體pPIC9