Id1基因表達(dá)與垂體腺瘤的侵襲性研究.pdf

1、目的：研究Id1蛋白在侵襲性垂體腺瘤組織中的表達(dá)及意義，構(gòu)建代號(hào)為NQ-04的原代侵襲性垂體腺瘤細(xì)胞株，探討siRNA轉(zhuǎn)染后NQ-04細(xì)胞侵襲性的改變，從而為臨床診斷和治療侵襲性垂體腺瘤提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴Western blot分別檢測Id1蛋白在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)。我們從本院收集的45例術(shù)中新鮮冰凍垂體腺瘤中隨機(jī)選取15例侵襲性垂體瘤和15例非侵襲性垂體瘤提取全蛋白，提取的總蛋白，加入2xSDS

2、蛋白上樣緩沖液（按1∶1比例），于100℃煮沸5min。Westernblot方法檢測后觀察凝膠圖像，應(yīng)用AdobePhotoshop圖像軟件掃描Western blot凝膠圖片，得到相應(yīng)灰度值，分析Id1蛋白在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)是否有顯著差異。⑵構(gòu)建代號(hào)為NQ-04的原代侵襲性垂體腺瘤細(xì)胞株。術(shù)中取出垂體腺瘤組織后，在無菌條件下放入PBS溶液中，封口膜封口，置于冰桶中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。通過機(jī)械消化和酶消化結(jié)合方法分離細(xì)胞。本

3、課題組利用侵性垂體腺瘤新鮮組織樣本原代培養(yǎng)成代號(hào)為NQ-04的細(xì)胞。⑶siRNA-Id1轉(zhuǎn)染NQ-04細(xì)胞。siRNA用無RNA酶H20稀釋成20umol/L，分裝儲(chǔ)存于-20℃。轉(zhuǎn)染時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，按照2.5∶1比例和lipotaminelTM2000混勻，室溫靜置20min，然后按照不同終濃度加入不含血清的培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)6h后換成含10％血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24-72h。⑷Western blot檢測siRNA-Id1轉(zhuǎn)染后

4、NQ-04細(xì)胞中的Id1蛋白表達(dá)，檢驗(yàn)Id1基因沉默效率。⑸移行小室(Transwell)侵襲實(shí)驗(yàn)檢測siRNA轉(zhuǎn)染NQ-04細(xì)胞后對(duì)其侵襲能力的影響，200倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)膜背面的穿膜細(xì)胞，取平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　結(jié)果：①Id1基因在侵襲性垂體瘤中的表達(dá)明顯高于在非侵襲性垂體瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=15，t=2.725，p=0.013，p＜0.05)，也同樣進(jìn)一步提示Id1基因在侵襲性垂體瘤中具有調(diào)節(jié)作

5、用。②Id1蛋白在siRNA-id1轉(zhuǎn)染后的NQ-04細(xì)胞中表達(dá)顯著減低。③在200倍隨機(jī)選取的5個(gè)視野下計(jì)數(shù)對(duì)照組與干擾組細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)被siRNA-id1轉(zhuǎn)染的NQ-04細(xì)胞組為(40±16.54)，未被siRNA-id1轉(zhuǎn)染的NQ-04細(xì)胞組為(67±17.45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.972，p=0.016，p＜0.05)。表明轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾Id1后，NQ-04細(xì)胞的遷移能力明顯降低。Id1蛋白在siRNA-id1轉(zhuǎn)染后