PTEN和CIRP與垂體腺瘤侵襲性的相關(guān)性研究.pdf

1、垂體腺瘤(pituitary adenoma)是一種常見的顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10％，發(fā)病率僅次于腦膠質(zhì)瘤和腦膜瘤，居顱內(nèi)腫瘤第三位。侵襲性垂體腺瘤是一種界于良惡性之間的腫瘤，有著侵襲性生長的生物學(xué)行為，當(dāng)其侵入海綿竇累及頸內(nèi)動(dòng)脈、顱神經(jīng)、硬腦膜等結(jié)構(gòu)，即稱其為侵襲性垂體腺瘤。侵襲性垂體腺瘤臨床進(jìn)展迅速，發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤體積較大，往往伴有卒中、壞死，加以顱底結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，又有多種神經(jīng)和血管穿行，因此手術(shù)難度高、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)相對較大，同時(shí)又由于

2、侵襲性垂體腺瘤生長方式、侵襲海綿竇等部位導(dǎo)致手術(shù)顯露困難，術(shù)后腫瘤殘留率高。這些原因?qū)е虑忠u性垂體腺瘤的復(fù)發(fā)率極高，臨床療效較差，其治療效果一直困擾著臨床醫(yī)生，給患者帶來了極大的痛苦。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，對垂體腺瘤發(fā)病機(jī)制的研究最近也有很大的進(jìn)展，但是對于垂體腺瘤侵襲性的具體機(jī)制依然不十分明確，因此有必要進(jìn)一步研究垂體腺瘤的侵襲機(jī)制，以期尋找治療侵襲性垂體腺瘤的靶基因，提供新型的侵襲性垂體腺瘤診斷、治療方案及理論學(xué)基礎(chǔ)，以

3、減少垂體腺瘤的復(fù)發(fā)。
　　PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome10,PTEN)于1997年被發(fā)現(xiàn)，是一種抑癌基因，是第十號(hào)染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因。Hollander等研究顯示，它在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，它位于人類染色體的10q23.3，由九個(gè)外顯子所組成，是一個(gè)腫瘤抑制基因，顯示雙重特異性磷酸酶活性。PTEN能夠通過

4、調(diào)控多種腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等方式，對腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有抑制作用，PTEN能夠穩(wěn)定并提高腫瘤細(xì)胞間的黏附能力，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤血管生成、并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。突變的PTEN基因與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。PTEN發(fā)生缺失和突變在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著同樣重要的作用，Kato等研究表明，PTEN基因在大多數(shù)膠質(zhì)瘤中都表現(xiàn)出缺損，這在晚期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中更為明顯，能夠達(dá)到60％-80％之多;在

5、膠質(zhì)瘤惡性改變的過程中，PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失起著非常重要的作用。Idoate等人發(fā)現(xiàn)，PTEN基因雜和性缺失的頻率能夠隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增加而增加。大量研究證實(shí)，PTEN基因的突變或缺失與乳腺癌食管癌，前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展有著十分密切的聯(lián)系，腫瘤的惡性程度越高，PTEN的表達(dá)率越低。目前，基因缺失在垂體瘤的發(fā)病中的作用及機(jī)制的報(bào)道不多，抑癌基因發(fā)生突變與垂體腺瘤病程中的發(fā)生發(fā)展過程有一定的關(guān)系，因此PTEN的突變很可能與垂體腺瘤的侵襲力存

6、在一定的相關(guān)性，但是目前的研究報(bào)道較為罕見，有待進(jìn)一步明確。
　　冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein，CIRP）屬于一種新型的RNA結(jié)合蛋白，在人類位列于第19染色體p13.3的位點(diǎn)上。人們對第19號(hào)染色體進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中定位的基因超過1500個(gè)，是最高的基因密度的染色體，自然雜志于2004年發(fā)表了其基因的全序列。在第19號(hào)染色體上，有著特殊的特點(diǎn)，不僅G+C的含量較高，

7、而且所有基因的重排率也非常高，并且同樣有著很高的復(fù)制率，這些特點(diǎn)也能說明它的活躍度很高，在生物體進(jìn)化過程中有著十分重要的意義。在對遺傳疾病進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，很多這類基因都參與了其中。人體如果受到了外界的各種環(huán)境的污染，甚至受到了輻射污染，對被污染后損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)的基因也是位列于第19號(hào)染色體上。CIRP基因在人體的多種細(xì)胞上以及在大鼠的內(nèi)臟組織都有表達(dá)，如果機(jī)體發(fā)生了應(yīng)激，在不同部位上的CIRP基因的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化。CI

8、RP一類基因?qū)C(jī)體生理活性調(diào)節(jié)有著非常重要的作用，CIRP基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究顯示，基因的轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，對組織細(xì)胞的生長、增殖與分化都有著密切的調(diào)節(jié)作用，這種作用機(jī)制對多種基因的表達(dá)以及基因所表達(dá)的部位是否發(fā)生了異常都有著密切的調(diào)控作用，并最終對組織細(xì)胞發(fā)展分化方向進(jìn)行影響。最近的研究表明，CIRP有著癌基因的特性，Guo X等研究表明CIRP能夠引起人抗原R和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白E1出現(xiàn)異常的表達(dá)，這些異常的改變與乳腺癌

9、發(fā)病密切相關(guān)，Zeng發(fā)現(xiàn)當(dāng)CIRP蛋白活性被抑制后能夠降低前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，將CIRP基因沉默后可以促使腫瘤細(xì)胞死亡，存活率降低，并且能夠令腫瘤細(xì)胞在化療過程中對藥物的敏感性提高。并且有研究顯示，在不同的細(xì)胞系中，如HeLa、TERA2等細(xì)胞，CIRP基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致這類細(xì)胞的生長發(fā)生抑制，由此推測，在腫瘤的治療當(dāng)中，CIRP也許是一個(gè)新的潛在的作用靶點(diǎn)。在腫瘤的發(fā)生以及細(xì)胞生長過程的轉(zhuǎn)化中，基因翻譯水平發(fā)生了突變時(shí)會(huì)對其有著深

10、入的影響，CIRP在目前的研究中，發(fā)現(xiàn)它通過與翻譯元件發(fā)生相互作用，使得mRNA的翻譯獲得了促進(jìn)，令特定的蛋白的合成發(fā)生了加速，細(xì)胞增殖率提高。但目前為止，這些改變的調(diào)控機(jī)制仍不明確。Wang M等研究表明，CIRP基因與垂體腺瘤復(fù)發(fā)增殖密切相關(guān)，但由于樣本量小，CIRP與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系是需要進(jìn)一步研究的相關(guān)。
　　目的:
　　PTEN和CIRP表達(dá)改變與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系，目前研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對復(fù)發(fā)垂體腺瘤、侵

11、襲性垂體腺瘤、非侵襲性垂體腺瘤組織中PTEN和CIRP的表達(dá)情況進(jìn)行研究，分析其相關(guān)性。并與臨床資料相結(jié)合，研究他們在不同組織的表達(dá)情況及相關(guān)機(jī)制。對垂體腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討，從而為垂體腺瘤的診斷和治療提供新的實(shí)驗(yàn)理論支持。
　　方法：
　　1.選擇2014年1月到2016年1月間來臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的垂體腺瘤新鮮標(biāo)本60例，其中20例為復(fù)發(fā)垂體腺瘤。垂體腺瘤新鮮標(biāo)本通過影像學(xué)提

12、示，使用了Hardy-Wilson與Knosp的方法進(jìn)行分級(jí)，將其中的Ⅲ級(jí)以上或者是C期以上的垂體腫瘤劃分為侵襲性組別，其他則歸為非侵襲性組別，每組為20例患者。在研究過程中，所有納入研究的患者均自愿簽署知情同意書。手術(shù)過程中所獲得的病理標(biāo)本，分為兩部分，一小部分用作原代細(xì)胞培養(yǎng)，另外一部分則通過液氮保持，以做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)，結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)、western blot、real-time PCR及免疫組化在大體水平及

13、細(xì)胞水平探討PTEN與CIRP在垂體腺瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.非侵襲性垂體腺瘤PTEN無論是在免疫組化、western blot及PCR的檢測中均為最高，在侵襲性垂體腺瘤次之，而復(fù)發(fā)性垂體腺瘤則是最低，它們之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CIRP蛋白表達(dá)則是相反。由此推測，PTEN有抑制腫瘤發(fā)展的作用，而CIRP則是促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。
　　2.轉(zhuǎn)染了PTEN的細(xì)胞增殖較其余幾組慢，而轉(zhuǎn)染了CIRP組則有顯

14、著的細(xì)胞增殖情況，兩組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)采用了熒光顯微鏡進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與上述相同。轉(zhuǎn)染了PTEN的細(xì)胞侵襲能力較其余幾組明顯降低，而轉(zhuǎn)染了CIRP組則細(xì)胞侵襲力情況明顯增強(qiáng)，兩組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.基質(zhì)金屬蛋白酶能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大部分成分，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，本部分研究中探討了MMP-2與MMP-9在兩基因干預(yù)后的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示MMP-2與MMP-9在PTEN轉(zhuǎn)染組中，與對照組比

15、較有明顯的降低，兩者有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而在CIRP轉(zhuǎn)染組中，與對照組比較有升高趨勢，并且MMP-2的蛋白表達(dá)升高更為明顯，兩者有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.用western blot方法檢測各干預(yù)組的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9的表達(dá)，從各轉(zhuǎn)染組對GH3細(xì)胞干預(yù)后檢測凋亡相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，PTEN細(xì)胞凋亡最為明顯，而CIRP的細(xì)胞凋亡情況則是顯著低于PTEN組，兩者比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同

16、樣方法檢測各干預(yù)組的p-AKT的表達(dá)，從各轉(zhuǎn)染組對GH3細(xì)胞干預(yù)后檢測p-AKT水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，PTEN能夠抑制AKT信號(hào)通路的活化，而CIRP則是促進(jìn)AKT信號(hào)通路的活化。我們使用PI3K抑制劑LY294002對PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行阻斷后，再采用上述相同方法干預(yù)，再次探討AKT通路的活化情況，結(jié)果顯示，使用PI3K抑制劑后，能夠遏制了CIRP轉(zhuǎn)染組的AKT活化作用，而其余各種變化不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.在垂體腺瘤