羅氟司特對膿毒血癥小鼠的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：膿毒血癥是指由感染所引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，常伴隨多器官功能障礙，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。羅氟司特作為一種選擇性磷酸二酯酶抑制劑，具有強大的抗炎作用。于是，本課題采用盲腸結(jié)扎穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)的方法建立膿毒血癥小鼠模型，考察羅氟司特對膿毒血癥小鼠的作用及可能涉及的作用機制。
　　方法：1.采用CLP方法建立膿毒血癥小鼠模型。動物分組包括:假手術(shù)對照組、CLP模型組、

2、CLP+羅氟司特低、中、高劑量組(0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg)。在造模前7天開始灌胃給藥處理，每天一次。造模后，每天觀察小鼠一次，連續(xù)觀察7天，記錄小鼠死亡時間，觀察存活率變化;按照評分標準對小鼠狀態(tài)進行評分，觀察臨床得分的變化。采用統(tǒng)計學(xué)方法檢驗存活率的組間差異、臨床觀察得分的組間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，考察羅氟司特對膿毒血癥小鼠是否具有保護作用。
　　2.造模24h后，收集血液、腹腔灌洗液、肝、肺、脾

3、，將組織進行勻漿處理，采用平板表面涂布方法對樣品進行細菌計數(shù);將血液離心后收集血漿，組織進行勻漿處理，采用ELISA方法檢測五種樣品中TNF-α、IL-6的含量;檢測血漿中ALT、AST、LDH的含量，同時對肝、肺、脾組織切片進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。觀察這些指標在造模條件下的變化，羅氟司特對這些指標的影響，考察羅氟司特對膿毒血癥小鼠的保護作用可能涉及的途徑。
　　3.造模24h后，收集肝臟，將肝臟進行勻漿處理

4、，采用ELISA方法檢測肝臟中cAMP的含量，采用Western blot方法檢測cAMP下游信號分子(p-CREB、CREB)、NF-κB通路相關(guān)蛋白（IκB-α、全蛋白NF-κB p65、胞漿蛋白NF-κB p65、胞核蛋白NF-κB p65）、p38MAPK通路相關(guān)蛋白(p-p38MAPK、p38MAPK)、STAT3通路相關(guān)蛋白(p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、全蛋白STAT3、胞漿蛋白STAT3

5、、胞核蛋白STAT3)的蛋白表達。觀察這些蛋白在造模條件下的表達情況，以及羅氟司特對這些蛋白表達的影響，考察羅氟司特對膿毒血癥小鼠的保護作用可能涉及的信號通路。
　　結(jié)果：1.羅氟司特對膿毒血癥小鼠具有保護作用。存活率實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠沒有出現(xiàn)死亡，造模后小鼠的存活率明顯下降，羅氟司特處理能夠顯著提高小鼠存活率。臨床觀察得分結(jié)果顯示，假手術(shù)組的分數(shù)是最低的，模型組小鼠的評分在造模后顯著升高，羅氟司特處理可以顯著地降低評分，

6、將評分維持在較低水平。
　　2.羅氟司特通過作用于膿毒血癥的多個環(huán)節(jié)介導(dǎo)對膿毒血癥小鼠的保護作用。細菌計數(shù)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組各種樣本的細菌量均顯著增高。羅氟司特處理可以顯著降低腹腔灌洗液的細菌量，即局部細菌量，也可以明顯降低血液中的細菌量，即全身擴散的細菌量。此外，羅氟司特處理還可以有效降低肝、肺、脾中的細菌量。炎癥因子結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠各種樣本中IL-6、TNF-α的含量均顯著升高。羅氟司特處理能

7、夠顯著降低血液、腹腔灌洗液、肝臟中的IL-6、TNF-α水平。這提示羅氟司特能夠抑制膿毒血癥小鼠全身炎癥反應(yīng)、肝臟炎癥反應(yīng)。此外，羅氟司特對肺和脾的炎癥因子升高也有一定抑制作用。酶活力結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠AST、ALT水平顯著上升，而羅氟司特處理顯著降低ALT、AST水平，這提示羅氟司特能夠緩解膿毒血癥小鼠肝組織損傷，HE切片結(jié)果進一步證實了羅氟司特的保護作用。此外，羅氟司特還可以一定程度緩解膿毒血癥肺損傷、脾損傷。

8、r>　　3.羅氟司特對膿毒血癥小鼠的保護作用涉及多個信號通路。首先，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，造模后的cAMP含量和CREB磷酸化顯著下降，而羅氟司特能夠顯著抑制蛋白的下降，表明羅氟司特保護作用可能與cAMP/CREB的激活有關(guān)。此外，造模后IκB-α的降解、NF-κB p65核位移、p38MAPK磷酸化均顯著增強，而羅氟司特處理可以顯著抑制這些蛋白的變化，表明而且羅氟司特的保護作用可能與NF-κB、p38MAPK的抑制有關(guān)。同時，造模

9、后JAK1、JAK2、STAT3的磷酸化、STAT3核位移均顯著增強，而羅氟司特處理可以顯著抑制這些蛋白的變化，表明而且羅氟司特的保護作用可能與STAT3的抑制有關(guān)。
　　結(jié)論：1.羅氟司特能夠提高膿毒血癥模型小鼠的存活率、緩解膿毒血癥癥狀，具有保護作用。
　　2.羅氟司對特膿毒血癥模型小鼠的保護作用可能通過降低小鼠體內(nèi)的細菌量;降低炎癥因子IL-6、TNF-α水平，抑制炎癥;降低ALT、AST、LDH水平，減輕組織損傷。<