烏司他丁對膿毒血癥腎損傷腎小球血管內皮糖萼的保護作用及分子機制研究.pdf

1、背景：嚴重感染(severe sepsis)所繼發(fā)的膿毒血癥和多臟器功能障礙綜合征(multipleorgan dysfunction syndrome，MODS)是當前重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)內的主要死亡原因，也是當前重癥醫(yī)學面臨的主要焦點及難點。雖然對膿毒癥的病理生理學機制和臨床治療進行了大量研究，然而迄今為止患者的發(fā)病率和病死率仍然居高不下。膿毒血癥發(fā)生后腎臟往往是最容易遭受損傷的器官，根據(jù)醫(yī)

2、學界已基本達成共識的急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)標準（RIFLE標準），有近8％的住院病人及50％以上的ICU患者出現(xiàn)AKI。因此，AKI已成為現(xiàn)代醫(yī)院及ICU的主要臨床難題。此外，有確鑿證據(jù)表明，嚴重感染及膿毒血癥是導致危重癥患者發(fā)生AKI的最主要原因，在ICU中，大約50％以上的AKI由此引發(fā)。雖然目前臨床上臟器的支持治療和液體復蘇治療水平正日益增強，但由膿毒血癥所誘發(fā)的AKI的發(fā)生率及死亡率未有下

3、降，這可能與其確切的發(fā)病機制尚未明確有關。新近的研究發(fā)現(xiàn)膿毒血癥的主要病理生理機制——微循環(huán)障礙可能與內皮表面糖萼（glycocalyx，多糖-蛋白復合物）的狀態(tài)密切相關。越來越多的研究已認識到血管內皮糖萼對心血管疾病具有重要的意義。糖萼是襯于血管內皮細胞管腔膜側，覆蓋著一種富含多糖的絨毛狀細胞結構，作為心血管系統(tǒng)的重要屏障，將血液與組織分隔開來。結構完整的糖萼具有維持血管通透性，抑制細胞間粘附等血管保護作用，否則將最終導致組織水腫和臟

4、器功能障礙，并激發(fā)中性粒細胞與內皮粘附后所產生的炎癥爆發(fā)。既往研究已經發(fā)現(xiàn)膿毒血癥可導致腎小球毛細血管內皮糖萼破壞并伴有蛋白尿，同時該現(xiàn)象的發(fā)生與膿毒血癥后機體產生大量的(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能有關。然而這其中的確切機制尚不清楚，對于TNF-α的來源，自身的作用，與中性粒細胞貼壁之間的關系，其產生的調節(jié)機制以及其損傷糖萼的作用機制仍不清楚。烏司他?。╱rinary trypsin inhibit

5、or, UTI）:其以兩種前體分子形式存在于血漿中，inter-α-inhibitor(IαI)和pre-α-inhibitor(PαI)，其結構包括兩個Kunitz結構域，O-糖鏈、硫酸軟骨素，N-糖鏈，C端K區(qū):抑制多種水解酶，N端K區(qū):抑制組織蛋白酶G和彈性蛋白酶，O-硫酸軟骨素糖鏈:能與細胞、鈣等結合，與穩(wěn)定溶酶體、抑制炎性細胞釋放有關，N-糖鏈:調節(jié)內皮細胞與單核細胞、粒細胞、淋巴細胞的結合力。烏司他丁主要是通過兩個Kunit

6、z結構域，分別能抑制多種酶的活性，尤其是減少絲氨酸蛋白酶（包括組織蛋白酶，粒細胞彈性蛋白酶，纖溶酶，激肽原酶，胰蛋白酶或糜蛋白酶，類胰蛋白酶等）活性，通過抑制中性粒細胞，淋巴細胞，巨噬細胞，肥大細胞等過度激活，抑制纖維蛋白降解，抑制緩激肽生成而導致血管擴張，阻止蛋白酶活化受體激活，從而減少炎性細胞活化，將炎性反應局限化，減輕對正常組織的損傷，其直接作用于細胞前體，減少細胞因子的分泌，穩(wěn)定溶酶體膜，減少酶的釋放，達到緩解炎癥反應，改善微循

7、環(huán)的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)烏司他丁對膿毒血癥的腎血管內皮糖萼破壞的保護作用及其分子機制的相關研究。因此，本研究將選用脂多糖內毒素（lipopolysaccharide，LPS）誘導膿毒血癥的腎損傷大鼠在體模型，計劃對糖萼破壞與AKI發(fā)生相關的機制展開研究，并進一步探討腎臟血管內皮糖萼在膿毒血癥導致AKI的機制中的作用與地位——僅僅是炎癥作用的“靶子”，抑或是兼具炎癥爆發(fā)的“炸藥桶”。并擬從腎臟血管內皮糖萼的病理生理變化及相關分子水平闡述烏司

8、他丁對膿毒血癥腎損傷的保護作用和具體機制，旨在從藥物治療膿毒血癥后腎血管糖萼破壞提供基礎實驗依據(jù)。
　　目的：本研究探討烏司他丁對脂多糖內毒素誘導的膿毒血癥大鼠腎臟血管內皮的保護作用和分子機制，旨在從新的保護血管內皮細胞糖萼破壞的的藥物途徑上提供基礎實驗依據(jù)。
　　方法：⑴通過腹部皮下注射水合氯醛對大鼠實施麻醉，對其右側頸靜脈進行置管。通過尾靜脈注射脂多糖，監(jiān)測平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）及

9、在0，180，360分鐘進行血清學(creatinine，Cr)，(blood usea nitrogen，BUN)等相關檢測。⑵應用激光多普勒儀(Moor Instruments，Axminister, England)檢測法在活體狀態(tài)下觀察腎臟皮質微循環(huán)血流狀態(tài)及灌注并進行實時計算。⑶通過電鏡直接觀察膿毒血癥大鼠腎小球毛細血管內皮糖萼結構及厚度，通過檢測外周血，腎靜脈血(heparan sulfate，HS)和syndecan-1水

10、平來間接評估腎小球毛細血管內皮糖萼的破壞。⑷免疫組化檢測腎小球毛細血管內皮細胞漿內(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38 MAPK)、(nuclear factor of kB，NF-kB)分子表達:通過對外周血和腎靜脈血中TNF-α炎性介質（流式細胞儀檢測）的濃度及腎小球毛細血管內皮細胞內(Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)家族分子及NF-κB分子表達的檢測

11、。
　　結果：①大鼠尾靜脈注射LPS（10μg/g）后，內毒素組大鼠平均動脈壓進行性下降，生理鹽水干預組與烏司他丁組經補液復蘇及血管活性藥物支持下，平均動脈壓呈現(xiàn)逐步上升，而腎臟微循環(huán)血流監(jiān)測顯示仍呈下降趨勢。②正常標準對照組大鼠腎臟毛細血管糖萼層完整連續(xù)，厚約200nm;膿毒血癥后腎臟毛細血管糖萼不連續(xù)，結構松散，變薄。生理鹽水干預組和烏司他丁藥物干預組大鼠腎臟毛細血管糖萼結構同樣存在不連續(xù)，較正常組松散，腫脹。膿毒血癥發(fā)生后1

12、小時大鼠腎臟靜脈及外周血中HS、syndecan-1濃度即出現(xiàn)明顯的升高，且其較高濃度維持的時間較長。③膿毒血癥發(fā)生后0.5小時大鼠腎臟靜脈血中TNF-α濃度即出現(xiàn)明顯的升高，且其較高濃度維持的時間較長（3小時后迅速下降），而外周血TNF-α濃度的峰值明顯低于腎靜脈血。相對于標膿毒血癥組及生理鹽水干預組大鼠，烏司他丁能夠降低腎靜脈血和外周血中TNF-α的高峰濃度及其持續(xù)時間(P＜0.05)。④脂多糖內毒素誘導的膿毒血癥腎損傷模型組大鼠腎

13、小球毛細血管內皮細胞漿內NF-kB分子表達比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，而烏司他丁藥物治療組較膿毒血癥組也表現(xiàn)為明顯降低(P＜0.05)，其余組間比較無顯著性差異。⑤脂多糖內毒素誘導的膿毒血癥腎損傷模型組大鼠腎小球毛細血管內皮細胞漿內P38 MAPK分子表達比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，而烏司他丁藥物治療組較膿毒血癥組表現(xiàn)為明顯降低(P＜0.05)，其余組間比較無顯著性差異。
　　結論：烏司他丁能減輕脂多糖內毒素誘