烏司他丁對膿毒血癥腎損傷腎小球血管內(nèi)皮糖萼的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：嚴(yán)重感染(severe sepsis)所繼發(fā)的膿毒血癥和多臟器功能障礙綜合征(multipleorgan dysfunction syndrome，MODS)是當(dāng)前重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)內(nèi)的主要死亡原因，也是當(dāng)前重癥醫(yī)學(xué)面臨的主要焦點(diǎn)及難點(diǎn)。雖然對膿毒癥的病理生理學(xué)機(jī)制和臨床治療進(jìn)行了大量研究，然而迄今為止患者的發(fā)病率和病死率仍然居高不下。膿毒血癥發(fā)生后腎臟往往是最容易遭受損傷的器官，根據(jù)醫(yī)

2、學(xué)界已基本達(dá)成共識的急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)標(biāo)準(zhǔn)（RIFLE標(biāo)準(zhǔn)），有近8％的住院病人及50％以上的ICU患者出現(xiàn)AKI。因此，AKI已成為現(xiàn)代醫(yī)院及ICU的主要臨床難題。此外，有確鑿證據(jù)表明，嚴(yán)重感染及膿毒血癥是導(dǎo)致危重癥患者發(fā)生AKI的最主要原因，在ICU中，大約50％以上的AKI由此引發(fā)。雖然目前臨床上臟器的支持治療和液體復(fù)蘇治療水平正日益增強(qiáng)，但由膿毒血癥所誘發(fā)的AKI的發(fā)生率及死亡率未有下

3、降，這可能與其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確有關(guān)。新近的研究發(fā)現(xiàn)膿毒血癥的主要病理生理機(jī)制——微循環(huán)障礙可能與內(nèi)皮表面糖萼（glycocalyx，多糖-蛋白復(fù)合物）的狀態(tài)密切相關(guān)。越來越多的研究已認(rèn)識到血管內(nèi)皮糖萼對心血管疾病具有重要的意義。糖萼是襯于血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔膜側(cè)，覆蓋著一種富含多糖的絨毛狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作為心血管系統(tǒng)的重要屏障，將血液與組織分隔開來。結(jié)構(gòu)完整的糖萼具有維持血管通透性，抑制細(xì)胞間粘附等血管保護(hù)作用，否則將最終導(dǎo)致組織水腫和臟

4、器功能障礙，并激發(fā)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮粘附后所產(chǎn)生的炎癥爆發(fā)。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膿毒血癥可導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮糖萼破壞并伴有蛋白尿，同時該現(xiàn)象的發(fā)生與膿毒血癥后機(jī)體產(chǎn)生大量的(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能有關(guān)。然而這其中的確切機(jī)制尚不清楚，對于TNF-α的來源，自身的作用，與中性粒細(xì)胞貼壁之間的關(guān)系，其產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制以及其損傷糖萼的作用機(jī)制仍不清楚。烏司他?。╱rinary trypsin inhibit

5、or, UTI）:其以兩種前體分子形式存在于血漿中，inter-α-inhibitor(IαI)和pre-α-inhibitor(PαI)，其結(jié)構(gòu)包括兩個Kunitz結(jié)構(gòu)域，O-糖鏈、硫酸軟骨素，N-糖鏈，C端K區(qū):抑制多種水解酶，N端K區(qū):抑制組織蛋白酶G和彈性蛋白酶，O-硫酸軟骨素糖鏈:能與細(xì)胞、鈣等結(jié)合，與穩(wěn)定溶酶體、抑制炎性細(xì)胞釋放有關(guān)，N-糖鏈:調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的結(jié)合力。烏司他丁主要是通過兩個Kunit

6、z結(jié)構(gòu)域，分別能抑制多種酶的活性，尤其是減少絲氨酸蛋白酶（包括組織蛋白酶，粒細(xì)胞彈性蛋白酶，纖溶酶，激肽原酶，胰蛋白酶或糜蛋白酶，類胰蛋白酶等）活性，通過抑制中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞等過度激活，抑制纖維蛋白降解，抑制緩激肽生成而導(dǎo)致血管擴(kuò)張，阻止蛋白酶活化受體激活，從而減少炎性細(xì)胞活化，將炎性反應(yīng)局限化，減輕對正常組織的損傷，其直接作用于細(xì)胞前體，減少細(xì)胞因子的分泌，穩(wěn)定溶酶體膜，減少酶的釋放，達(dá)到緩解炎癥反應(yīng)，改善微循

7、環(huán)的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)烏司他丁對膿毒血癥的腎血管內(nèi)皮糖萼破壞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制的相關(guān)研究。因此，本研究將選用脂多糖內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)膿毒血癥的腎損傷大鼠在體模型，計(jì)劃對糖萼破壞與AKI發(fā)生相關(guān)的機(jī)制展開研究，并進(jìn)一步探討腎臟血管內(nèi)皮糖萼在膿毒血癥導(dǎo)致AKI的機(jī)制中的作用與地位——僅僅是炎癥作用的“靶子”，抑或是兼具炎癥爆發(fā)的“炸藥桶”。并擬從腎臟血管內(nèi)皮糖萼的病理生理變化及相關(guān)分子水平闡述烏司

8、他丁對膿毒血癥腎損傷的保護(hù)作用和具體機(jī)制，旨在從藥物治療膿毒血癥后腎血管糖萼破壞提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：本研究探討烏司他丁對脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒血癥大鼠腎臟血管內(nèi)皮的保護(hù)作用和分子機(jī)制，旨在從新的保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞糖萼破壞的的藥物途徑上提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴通過腹部皮下注射水合氯醛對大鼠實(shí)施麻醉，對其右側(cè)頸靜脈進(jìn)行置管。通過尾靜脈注射脂多糖，監(jiān)測平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）及

9、在0，180，360分鐘進(jìn)行血清學(xué)(creatinine，Cr)，(blood usea nitrogen，BUN)等相關(guān)檢測。⑵應(yīng)用激光多普勒儀(Moor Instruments，Axminister, England)檢測法在活體狀態(tài)下觀察腎臟皮質(zhì)微循環(huán)血流狀態(tài)及灌注并進(jìn)行實(shí)時計(jì)算。⑶通過電鏡直接觀察膿毒血癥大鼠腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)及厚度，通過檢測外周血，腎靜脈血(heparan sulfate，HS)和syndecan-1水

10、平來間接評估腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮糖萼的破壞。⑷免疫組化檢測腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38 MAPK)、(nuclear factor of kB，NF-kB)分子表達(dá):通過對外周血和腎靜脈血中TNF-α炎性介質(zhì)（流式細(xì)胞儀檢測）的濃度及腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)(Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)家族分子及NF-κB分子表達(dá)的檢測

11、。
　　結(jié)果：①大鼠尾靜脈注射LPS（10μg/g）后，內(nèi)毒素組大鼠平均動脈壓進(jìn)行性下降，生理鹽水干預(yù)組與烏司他丁組經(jīng)補(bǔ)液復(fù)蘇及血管活性藥物支持下，平均動脈壓呈現(xiàn)逐步上升，而腎臟微循環(huán)血流監(jiān)測顯示仍呈下降趨勢。②正常標(biāo)準(zhǔn)對照組大鼠腎臟毛細(xì)血管糖萼層完整連續(xù)，厚約200nm;膿毒血癥后腎臟毛細(xì)血管糖萼不連續(xù)，結(jié)構(gòu)松散，變薄。生理鹽水干預(yù)組和烏司他丁藥物干預(yù)組大鼠腎臟毛細(xì)血管糖萼結(jié)構(gòu)同樣存在不連續(xù)，較正常組松散，腫脹。膿毒血癥發(fā)生后1

12、小時大鼠腎臟靜脈及外周血中HS、syndecan-1濃度即出現(xiàn)明顯的升高，且其較高濃度維持的時間較長。③膿毒血癥發(fā)生后0.5小時大鼠腎臟靜脈血中TNF-α濃度即出現(xiàn)明顯的升高，且其較高濃度維持的時間較長（3小時后迅速下降），而外周血TNF-α濃度的峰值明顯低于腎靜脈血。相對于標(biāo)膿毒血癥組及生理鹽水干預(yù)組大鼠，烏司他丁能夠降低腎靜脈血和外周血中TNF-α的高峰濃度及其持續(xù)時間(P＜0.05)。④脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒血癥腎損傷模型組大鼠腎

13、小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)NF-kB分子表達(dá)比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，而烏司他丁藥物治療組較膿毒血癥組也表現(xiàn)為明顯降低(P＜0.05)，其余組間比較無顯著性差異。⑤脂多糖內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒血癥腎損傷模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)P38 MAPK分子表達(dá)比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，而烏司他丁藥物治療組較膿毒血癥組表現(xiàn)為明顯降低(P＜0.05)，其余組間比較無顯著性差異。
　　結(jié)論：烏司他丁能減輕脂多糖內(nèi)毒素誘