TIGIT和PD-1介導(dǎo)肝泡型包蟲病患者T淋巴細(xì)胞免疫耗竭的研究.pdf

1、目的：泡型包蟲?。ˋlveolar Echinococcosis, AE）類似侵襲性生長的“肝癌”。目前大量的研究工作表明，宿主的免疫狀態(tài)是影響多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis, E. m）感染寄生、病灶活性及疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素。本研究旨在探討免疫抑制性分子TIGIT和PD-1介導(dǎo)肝AE患者T細(xì)胞免疫耗竭的機(jī)制。
　　方法：第一部分，1.利用26例 AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本，病理切片觀察肝臟病灶周圍“

2、活躍浸潤增殖區(qū)-炎癥微環(huán)境”形成，以及炎性細(xì)胞浸潤和肝臟病理表現(xiàn)；利用 Masson染色和免疫組織化學(xué)檢測 AE患者肝臟纖維化程度和肝星狀細(xì)胞的活化，實(shí)時熒光定量驗(yàn)證α-SMA、COL1A1和COL3A1的表達(dá)變化；免疫熒光技術(shù)鑒定肝臟病灶周圍“炎癥微環(huán)境”募集的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群；血清學(xué)測定肝損傷特異性指標(biāo)ALT和AST。2.利用6例AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本，通過高通量技術(shù)篩選肝臟區(qū)域關(guān)鍵免疫抑制性分子表達(dá)變化；實(shí)時熒光定量驗(yàn)證篩選的部分差

3、異表達(dá)基因，分析免疫抑制性分子與T淋巴細(xì)胞表面特異性標(biāo)記分子、抑制性炎性因子的相關(guān)性。第二部分，1.利用20例 AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本，膠原酶消化分離肝臟淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測病灶近旁肝臟組織與遠(yuǎn)端肝臟組織T細(xì)胞的比例，及其表面TIGIT和PD-1表達(dá)變化，分析其比例變化與 AE患者病灶活性的關(guān)系；利用免疫熒光技術(shù)等技術(shù)檢測TIGIT和PD-1免疫定位和共定位，及其配體CD155和PD-L1的細(xì)胞定位；利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測近旁肝臟組織TIGIT或PD-1陽性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異變化。2.利用45例 AE患者和健康志愿者外周血標(biāo)本，密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞的比例及其表面TIGIT和PD-1表達(dá)變化，分析與AE患者病灶活性關(guān)系；分析T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1表達(dá)與血清蟲體特異性抗體Em2水平相關(guān)性；利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測AE患者外周血TIGIT

5、或PD-1陽性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞增殖能力的變化，及其分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異；進(jìn)一步通過TIGIT和PD-1抗體封閉，檢測T細(xì)胞增殖能力的變化。第三部分（1）建立低（50,250 PSCs）、中（500 PSCs）、高（1000,2000 PSCs）三種不同劑量泡球蚴經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型，大體觀察和分析不同劑量小鼠模型肝臟表面病灶的大小和數(shù)量；病理切片觀察肝臟免疫病理變化、微觀病灶數(shù)

6、量、肉芽腫反應(yīng)類型；天狼星紅染色和免疫組織化學(xué)檢測肝纖維化程度和肝星狀細(xì)胞的活化，實(shí)時熒光定量驗(yàn)證α-SMA和COL1A1的表達(dá)變化。2.分離肝臟單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同淋巴細(xì)胞絕對數(shù)，T淋巴細(xì)胞表型變化（CD69, CD44和CD62L），以及不同T細(xì)胞亞群（T1、T2、T17和 Treg型）比例變化；實(shí)時熒光定量檢測肝臟組織T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化。3.通過不同劑量E. m感染小鼠模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟區(qū)域和脾臟T細(xì)

7、胞表面TIGIT和PD-1表達(dá)變化，以及共表達(dá)情況；利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測TIGIT或PD-1陽性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α的差異變化。
　　結(jié)果：第一部分，1. AE患者肝臟病灶周圍形成“炎癥微環(huán)境”，主要以CD8+ T淋巴細(xì)胞浸潤為主炎性細(xì)胞帶，伴隨CD4+ T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤。2.基因芯片高通量篩選，發(fā)現(xiàn)AE患者肝臟病灶周圍免疫反應(yīng)相關(guān)

8、趨化因子（CCL3、CCL8、CCL17、CCL18、CCL19、CCL21、CCL26）、淋巴細(xì)胞表面分子（CD69、CD44、CD1E、CD8B、CD27）、免疫抑制性分子（CTLA4、CRTAM、BTLA、TIGIT）和炎性細(xì)胞因子（IL-10、IFN-γ、IDO1）等呈上調(diào)表達(dá)，其中TIGIT、IL-10和IFN-γ基因的上調(diào)倍數(shù)分別為2.07、3.72和3.19；通過實(shí)時熒光定量驗(yàn)證和相關(guān)性分析顯示，TIGIT和PD-1分子分

9、別與CD4（TIGIT, r=0.3083, P=0.1524; PD-1, r=0.4749, P=0.0255）、CD8（TIGIT, r=0.6631, P=0.0003;PD-1, r=0.6652, P=0.0004），以及抑制性炎性細(xì)胞因子IL-10（TIGIT, r=0.7938, P<0.0001;PD-1, r=0.4980, P=0.0156）呈正相關(guān)性，TIGIT和PD-1也呈正相關(guān)性（r=0.7304, P<0.

10、0001）。第二部分，1. AE患者肝臟區(qū)域TIGIT和PD-1單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)于CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面，導(dǎo)致肝臟局部 CD4+ T和 CD8+ T細(xì)胞分泌效應(yīng)分子 Granzyme B（CD8+PD-1+ vs CD8+PD-1-:8.00±3.03％ vs32.0±8.32%, P<0.05）、細(xì)胞因子IFN-γ（CD4+TIGIT+ vs CD4+TIGIT-:8.18±2.65%vs17.8±3.95%, P<0.05）

11、、細(xì)胞因子TNF-α（CD8+TIGIT+vs CD8+TIGIT-:9.67±2.56% vs18.9±3.92%, P<0.001; CD8+PD-1+ vs CD8+PD-1-:7.22±2.71% vs24.7±4.48%, P<0.01）能力降低。2. AE患者肝臟病灶周圍肝細(xì)胞為CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面TIGIT提供配體CD155，巨噬細(xì)胞表面PD-1提供配體PD-L1。3. AE患者外周血CD8+ T細(xì)胞顯著增加（P

12、<0.01），TIGIT和PD-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)于CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞表面（CD8+TIGIT+ T cells, HL vs AE:34.3±2.40% vs48.9±2.62%, P<0.001; CD8+PD-1+T cells, HL vs AE:18.6±1.39% vs23.3±1.64%, P<0.05），其中PD-1陽性CD4+T或CD8+T細(xì)胞比例增加伴隨AE患者血清中抗Em2抗體水平增加（CD4+PD

13、-1+T cellss, Em2,+vs++vs+++:3.41±0.70%vs6.91±1.00%vs6.91±1.00%, P<0.05）；AE患者外周TIGIT或PD-1陽性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞相比，其分泌Granzyme B、Perforin、IFN-γ和TNF-α能力降低，其中CD8+ T細(xì)胞 TIGIT陽性細(xì)胞群增殖能力顯著下降（CD8+TIGIT+ vs CD8+TIGIT-:38.7% vs67.7%, P<0.05）

14、；通過TIGIT抗體封閉，能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖。4.依據(jù)PET/CT影像學(xué)分組，高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+T細(xì)胞呈TIGIT和PD-1上調(diào)表達(dá)（肝臟,高 vs低活躍型: TIGIT,31.7±9.09% vs26.4±11.0%; PD-1,19.8±8.57% vs12.1±2.08%, P>0.05.外周血,高 vs低活躍型:51.6±14.7%vs38.2±15.1%, P<0.05;PD-1,

15、22.1±11.7%vs15.9±10.0%, P>0.05）。第三部分，1.成功建立了 E. m經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型，低和中劑量感染早期，肝臟局部形成T1型（CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+）和T17型細(xì)胞亞群優(yōu)勢，促進(jìn)宿主對低中劑量E. m感染的清除；而高劑量感染晚期，肝臟局部形成以CD8+T細(xì)胞占優(yōu)勢―炎癥微環(huán)境‖，肝臟局部形成 T2型和 T17型細(xì)胞亞群優(yōu)勢，并且 Treg型（CD4+IL-10+和CD8+IL-10

16、+）細(xì)胞亞群比例趨于上調(diào)趨勢，促進(jìn)高劑量E. m感染在宿主肝臟的慢性寄生。2.高劑量E. m感染中晚期，誘導(dǎo)肝臟局部CD4+T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)上調(diào)（P<0.05或P<0.001），CD8+T細(xì)胞表面TIGIT分子表達(dá)上調(diào)（24周，CD8+TIGIT+T cells,對照 vs低 vs周 vs高劑量組:8.91±2.29% vs12.3±1.45% vs8.90±0.99% vs15.5±2.15%, P<

17、0.05），其中TIGIT或PD-1陽性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。3.不同劑量E. m感染中晚期，脾臟CD4+T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)上調(diào)（24周，CD4+TIGIT+T cells,對照 vs低 vs周 vs高劑量組:15.7±2.54%vs28.8±2.10%vs27.6±3.46%vs28.0±2.82%, P<0.05;CD

18、4+PD-1+T cells,對照 vs低 vs周 vs高劑量組:28.2±4.20% vs42.6±2.59% vs45.6±5.25% vs39.7±2.41%, P<0.05），TIGIT或PD-1陽性CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α能力下降，TIGIT或PD-1陽性CD8+T細(xì)胞分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。
　　結(jié)論：1. AE患者肝臟區(qū)域存在“炎癥微環(huán)境”，形成以CD8

19、+ T細(xì)胞浸潤為主炎性細(xì)胞帶，周圍肝細(xì)胞提供配體CD155與TIGIT相互作用，巨噬細(xì)胞提供配體PD-L1與PD-1相互作用，可能以CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1結(jié)合模式介導(dǎo)抑制性信號傳遞，導(dǎo)致肝臟局部 T細(xì)胞功能降低，促進(jìn) T細(xì)胞耗竭。2.高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+ T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子協(xié)同性上調(diào)表達(dá)，造成效應(yīng)性T細(xì)胞功能下降，促進(jìn)E. m活躍性或侵襲性生長。利用TIGIT抗體封閉，能夠促進(jìn)T