PD-1在腫瘤患者PBMC中的表達(dá)情況及其對T淋巴細(xì)胞體外殺傷活性的影響.pdf

1、目的：
　　PD-1（Programmed death-1，程序性死亡分子1）是T淋巴細(xì)胞耗竭和功能失調(diào)的標(biāo)志，T淋巴細(xì)胞表面PD-1的過高表達(dá)可能會(huì)影響其增殖能力和殺傷活性。本研究通過檢測腫瘤患者PBMC（peripheral blood mononuclear cell，外周血單個(gè)核細(xì)胞）中PD-1的表達(dá)情況，分析其與腫瘤患者臨床資料的相關(guān)性，驗(yàn)證其作為評(píng)估腫瘤患者免疫狀態(tài)的指標(biāo)可行性；通過體外阻斷抗原特異性T淋巴細(xì)胞表面PD

2、-1的表達(dá)，分析其對T淋巴細(xì)胞體外殺傷活性的影響，并探討PD-1單克隆抗體與抗原特異性T細(xì)胞免疫療法聯(lián)合應(yīng)用的可能性。
　　方法：
　　用流式細(xì)胞儀檢測276例腫瘤患者及58例健康人PBMC表面PD-1的表達(dá)情況，分析PD-1分子的表達(dá)與CD3+CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和記憶性 T細(xì)胞相關(guān)性，對腫瘤患者的免疫狀態(tài)進(jìn)行初步評(píng)估。其次從腫瘤患者外周血分離PBMC細(xì)胞，利用GM-CSF、IL-4等細(xì)胞因子培養(yǎng)DC（Dendrit

3、ic cell，樹突狀細(xì)胞），同時(shí)用anti-CD3mAb、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子體外擴(kuò)增培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，再將其與腫瘤抗原預(yù)激的DC共孵育，最終發(fā)展為效應(yīng)性T細(xì)胞。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)的過程中加入抗PD-1單克隆抗體(10?g/mL)阻斷T淋巴細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)，對照組加入IgG1κ同型對照抗體(10?g/mL)，檢測兩組T淋巴細(xì)胞的增殖情況和PD-1的表達(dá)情況，同時(shí)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子I

4、L-2，IL-4，IFN-γ和TNF-a的分泌量，最后用WST-1法比較兩組 T淋巴細(xì)胞對三種不同的腫瘤細(xì)胞株HGC-27，SW480和CNE-2的特異性殺傷活性。
　　結(jié)果：
　　(1)腫瘤患者PBMC中的PD-1的表達(dá)率明顯高于健康人(P<0.001)，并且與胃癌患者的臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　(2) PD-1的表達(dá)與CD3+CD8+CTL（cytotoxic lymphocyte，細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)

5、胞）以及CD45RO+CD62LˉTEM（effector memory T cell，效應(yīng)記憶性T細(xì)胞）的含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。
　　(3)抗PD-1單克隆抗體阻斷T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)后，PD-1的表達(dá)率明顯下降(P<0.001)，而對T淋巴細(xì)胞的增殖活性無明顯影響(P>0.05)。
　　(4) ELISA結(jié)果顯示:阻斷PD-1的表達(dá)后T淋巴細(xì)胞分泌的IL-2，IL-4，IFN-γ和TNF-a均明顯高于I

6、gG對照組(P<0.001)。
　　(5)WST-1殺傷實(shí)驗(yàn)顯示：PD-1阻斷組的T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞株HGC-27，SW480和CNE-2的殺傷活性均明顯高于IgG對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)PD-1在腫瘤患者PBMC中的平均表達(dá)率高于健康人，PD-1的高表達(dá)在一定程度上反映了T淋巴細(xì)胞功能耗竭的狀態(tài)，通過流式檢測腫瘤患者PBMC中PD-1的表達(dá)可以作為抗PD-1單克隆抗體療效預(yù)