水稻二氫乳清酸脫氫酶基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、嘧啶核苷酸是生物體內(nèi)非常重要的一類低分子化合物，具有極其重要的生理功能，它們不僅是DNA、RNA合成的前體，也作為生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)物質(zhì)參與生物體內(nèi)多聚糖、糖蛋白和磷脂等多種物質(zhì)的代謝過(guò)程。因此，嘧啶核苷酸的代謝及其在細(xì)胞間的儲(chǔ)備量直接影響著整個(gè)細(xì)胞的正常代謝和生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。 尿嘧啶單核苷酸(UMP)是生物體內(nèi)合成的第一個(gè)嘧啶核苷酸，UMP的合成包括“從頭合成”(De novo biosynthesis)和“補(bǔ)救合成”(Sa

2、lvage biosynthesis)兩種途徑，從頭合成途徑又稱“乳清酸途徑”，由6種酶催化完成，二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)催化UMP從頭合成途徑中的第四步反應(yīng)。目前僅在擬南芥和煙草中分離到DHODH基因，其他植物中未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 本論文從單子葉植物水稻中分離了兩個(gè)二氫乳清酸脫氫酶基因，分別命名為OsDHODH1和OsDHODH2(Oryza sativa dihydroorotate dehydrogenase)，彼此間序

3、列一致性僅25％，在GenBank中的登錄號(hào)分別為DQ102485和DQ269457。將OsDHODH1和OsDHODH2兩個(gè)基因的ORF序列分別連入表達(dá)載體pET-30a(+)中形成融合基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株進(jìn)行原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsDHODH1和OsDHODH2均能高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可催化二氫乳清酸脫氫氧化生成乳清酸的反應(yīng)，表明OsDHODH1和OsDHODH2為編碼二氫乳清酸脫氫酶的同工酶基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Os

4、DHODH1::GUS和OsDHODH2::GUS融合基因轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，顯微觀察證實(shí)OsDHODH1分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中；而OsDHODH2在細(xì)胞內(nèi)呈區(qū)域性分布，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)其可能定位于線粒體中。初步判斷，OsDHODH1和OsDHODH2是兩個(gè)亞細(xì)胞定位不同的同工酶基因，分屬于DHODH的兩個(gè)亞家族Family1和Family2。 利用半定量RT-PCR法進(jìn)行組織表達(dá)分析，結(jié)果表明OsDHODH1和OsDHO

5、DH2在水稻幼苗期和成株期的根、莖、葉及幼穗中均呈較高豐度的組成性表達(dá)，暗示兩個(gè)二氫乳清酸脫氫酶基因在水稻整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都起著重要作用。誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果表明OsDHODH1和OsDHODH2的表達(dá)均不同程度地受到高鹽、干旱、高溫、低溫及ABA處理的誘導(dǎo)。細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明OsDHODH1和OsDHODH2均能顯著地提高大腸桿菌對(duì)高鹽和滲透脅迫的耐受性。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)水稻的二氫乳清酸脫氫酶及嘧啶核苷酸從頭合