家蠶類 ω3--Δ6-脂肪酸脫氫酶基因克隆、表達及功能研究.pdf

1、家蠶是重要的經濟昆蟲之一，也是非常重要的模式昆蟲和實驗材料，蠶蛹是重要的蠶桑產業(yè)副產物，對蠶蛹脂肪酸組成及其合成機制的研究可以為蠶蛹的綜合利用提供理論依據，對家蠶脂肪酸合成代謝的分子機制研究顯得十分必要。本論文基于家蠶最新基因組數據庫資源，通過生物信息分析方法對家蠶脂肪脫氫酶進行克隆、序列分析，并對家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因進行了表達模式、原核表達、釀酒酵母表達等研究，為探究BmFAD3-like和BmD6DES基因

2、的功能，對低溫誘導、真菌侵染和RNAi的處理后的蠶蛹體內兩個基因的mRNA相對轉錄水平變化進行了初步研究。獲得如下研究結果：
　　1．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的克隆及序列分析
　　利用脂肪酸脫氫酶蛋白保守的組氨酸結構域序列對家蠶基因組序列進行同源性檢索，設計合成特異性引物，從蠶蛹中分別克隆到1083 bp和1335 bp的cDNA片段，分別命名為BmFAD3-like和BmD6DES。利用cDNA末端快

3、速快速擴增技術（RACE）對兩個脂肪酸脫氫酶基因進行了cDNA全長擴增，BmFAD3-like全長為1727 bp，開放閱讀框（ORF）全長1083 bp，編碼360個氨基酸，預測分子量為41.5 KDa，等電點為7.1；BmD6DES全長為2298 bp，開放閱讀框（ORF）全長1335 bp，編碼444個氨基酸，預測分子量為51.7 KDa，等電點8.05。兩條基因的編碼蛋白均不含信號肽序列?；诩倚Q及其它昆蟲脂肪酸脫氫酶蛋白保守序

4、列的多序列比對結果，構建了脂肪酸脫氫酶基因系統(tǒng)進化樹，BmFAD3-like和BmD6DES基因同昆蟲中已報道的其它脂肪酸脫氫酶基因之間的相似性較小。
　　2．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達模式研究
　　利用semi RT-PCR方法檢測家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因在家蠶個體發(fā)育過程中的表達模式研究。BmFAD3-like和BmD6DES兩個基因在家蠶大部分個體發(fā)育期都有表達，只是表達

5、量有差異。其中BmFAD3-like基因，從蟻蠶期到三齡眠期都有顯著表達，從4齡起蠶到成蛾產卵期持續(xù)顯著高表達，但是在卵期的表達極弱幾乎檢測不到。BmD6DES基因在家蠶不同發(fā)育時期的表達模式和BmFAD3-like基因非常相似，不同的是其在于蛹期特別是在蛹變態(tài)發(fā)育期的表達量明顯高于其他時期，并且在蛾后期表達有明顯的下降。通過分析家蠶幼蟲5齡3d各組織中BmFAD3-like和BmD6DES兩個基因的表達模式，BmFAD3-like基因

6、在幼蟲5齡第3天的各個組織器官中均有表達，特別是在卵巢、脂肪體、血淋巴、表皮和表達相對較高，在中腸、絲腺、精囊中表達量極少。同樣，BmD6DES基因在家蠶幼蟲5齡第3天各組織中也均有表達，特別是在脂肪體、表皮、精囊和卵巢表達相對較高，在中腸、絲腺、頭部和血淋巴中表達量極少。總之，家蠶脂肪酸脫氫酶基因主要在家蠶成蟲-蛹-蛾變態(tài)發(fā)育的后期和脂肪體、表皮和生殖器官中表達，推測其可能與家蠶脂質體的存儲、生殖發(fā)育、求偶交配、信息素合成有關。

7、>　　3．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因原核表達研究
　　將 BmFAD3-like和BmD6DES基因構建重組載體后轉入大腸桿菌表BL21(DE3)中，體外表達兩個基因的編碼蛋白并用含His-tag的層析柱純化所表達蛋白，原核表達的結果顯示，BmFAD3-like和 BmD6DES基因所編碼的蛋白使用最終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導4 h后，融合蛋白能夠被大腸桿菌高效表達；所表達的兩種融合蛋白為非可溶性蛋

8、白，在大腸桿菌內以包涵體形式存在；Western Blotting印跡結果驗證了重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得成功表達，電泳結果顯示所表達蛋白質分子量為44.3 KDa和54.8 KDa，其大小與預測的BmFAD3-like和BmD6DES基因編碼蛋白質相一致。
　　4．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因在釀酒酵母細胞表達研究
　　將 BmFAD3-like和BmD6DES基因雙酶切后構建到釀酒酵母表

9、達載體pYES2.0中，將工程菌株進行發(fā)酵，發(fā)酵液中添加2％的半乳糖糖誘導目的基因表達，亞油酸LA做為外源底物。氣相色譜分析工程菌發(fā)酵產物的脂肪酸成分，以只含pYES2.0空質粒的工程菌為對照。結果表明這兩個基因都能在酵母中表達，與對照相比pYBmFAD3-like發(fā)酵產物中產生了一種新的脂肪酸色譜峰，經鑒定為α-亞麻酸（ALA）即C18:3△9,12,15，含量占發(fā)酵產物總脂肪酸的2.8％，同樣 pYBmD6DES發(fā)酵產物中也產生了一

10、種新的脂肪酸色譜峰，經鑒定為γ-亞麻酸（GLA）即C18:3△6,9,12，含量占總脂肪酸的2.1％。
　　5．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達調控研究
　　為進一步探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達調控，我們對這兩個基因在蠶蛹受低溫誘導、真菌侵染和 siRNA介導的RNAi處置后的相對轉錄水平進行了qRT-PCR檢測。蠶蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因受低溫誘導后mRNA表

11、達量在0℃下36 h后有30%和28%的上調，但此后mRNA的相對轉錄水平和對照相比并無較大變化，推測低溫能誘導mRNA的上調表達，但是不能大幅度提升蛋白質（酶）的活性。BmFAD3-like和BmD6DES基因在真菌侵染的誘導下mRNA相對轉錄水平在6 h后有分別有160%和145%的上調，12 h后mRNA的相對轉錄水平超過對照量120%和110%，到60 h后蛹體內BmFAD3-like基因表達量不到對照的20%。蠶蛹BmD6DE