青蝦幾丁質(zhì)酶基因全長cDNA序列的克隆及時(shí)空表達(dá)分析.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)，俗稱河蝦，是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。2012年的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到了237，431噸，年產(chǎn)值超過150億。青蝦的生長、發(fā)育以及交配繁殖都與蛻殼（蛻皮）緊密相關(guān)。幾丁質(zhì)酶是在甲殼動(dòng)物蛻殼過程中起著重要的作用的幾種酶之一，與β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶聯(lián)合作用將幾丁質(zhì)聚合物水解成為幾丁質(zhì)單體，從而使舊的外殼脫落。除在蛻殼過程中發(fā)揮作用外，幾丁質(zhì)酶還具有多種生物學(xué)作用，如食物消化

2、、圍食膜的降解、免疫反應(yīng)等。鑒于幾丁質(zhì)酶基因在甲殼動(dòng)物中的作用，且在青蝦中至今沒有研究報(bào)道。因此，本文擬克隆出青蝦的幾丁質(zhì)酶家族基因，并將它們進(jìn)行系統(tǒng)分類和命名。通過研究它們的分子特征、組織分布、胚后發(fā)育以及在蛻殼周期過程中的時(shí)空表達(dá)模式，結(jié)合不同溫度下各幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)情況，進(jìn)而推斷出這些基因可能的生物學(xué)功能。
　　本文從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢文庫中篩選到28條幾丁質(zhì)酶基因的EST序列，將這些EST序列拼接后獲得5個(gè)幾丁質(zhì)酶基

3、因的中間序列，此外還通過同源克隆的方法獲得1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的中間序列。采用快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid-amplification ofcDNA ends，RACE)技術(shù)從青蝦中克隆出這6個(gè)幾丁質(zhì)酶基因(MnCht1A、MnCht1B、MnCht3A、MnCht3B、MnCht3C和MnCht4)的全長cDNA序列，它們的cDNA序列全長分別為1554、1529、2459、1359、1547和1941bp，分別編碼408、410、3

4、80、389、480、618個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)已有的報(bào)道，甲殼動(dòng)物具有6類(Group1～6)幾丁質(zhì)酶基因。本文中的6個(gè)幾丁質(zhì)酶基因可以分成三類(Group1、Group3和Group4)，Group1中具有MnCht1A和MnCht1B兩個(gè)基因，且這兩個(gè)基因編碼的氨基酸序列都缺少S/T富集的連接區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域;Group3中具有MnCht3A、MnCht3B和MnCht3C三個(gè)基因，只有MnCht3C編碼的氨基酸序列具有完整的幾

5、丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)，MnCht3A和MnCht3B編碼的氨基酸序列同樣缺少S/T富集的連接區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域;Group4中只有MnCht4一個(gè)基因，編碼的氨基酸序列具有完整的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)，且具有兩個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　6個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在成體青蝦10個(gè)組織（肌肉、表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、腦、腹神經(jīng)節(jié)、腸道、眼柄、鰓）中的分布不盡相同，MnCht1A和MnCht1B這兩個(gè)Group1幾丁質(zhì)酶基因主要分布在精巢、表皮、肝胰腺和腸組織中

6、。Group3中的MnCht1A、MnCht3B、MnCht3C這3個(gè)基因的組織分布具有較大的差異，僅有的共同特征是這3個(gè)基因都在肝胰腺和腸道這2個(gè)組織中表達(dá)，而且腸道中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝胰腺，這一表達(dá)特征與Group1中的兩個(gè)基因正好相反。MnCht3A在精巢、肝胰腺和腸道這3個(gè)組織中表達(dá);MnCht3B在表皮、精巢、肝胰腺、腸道和眼柄這5個(gè)組織中表達(dá)，與MnCht1A的組織分布很相似;MnCht3C僅在肝胰腺和腸道這兩個(gè)組織中表達(dá)

7、。MnCht4具有較為廣泛的組織分布，除了腦、腹神經(jīng)節(jié)和腸道這3個(gè)組織外，其余的7個(gè)組織（肌肉、表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、眼柄、鰓）都檢測(cè)到了MnCht4的表達(dá)。
　　胚后發(fā)育各時(shí)期(L1、L4、L7、L10、L13、PL1、PL5、PL10、PL15和PL20)的定量分析表明所有的基因在幼體期都沒有表達(dá)，直到變態(tài)發(fā)育完成后才開始表達(dá)，且MnCht1A、MnCht1B、MnCht3B和MnCht4四個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在PL1、PL5、

8、PL10、PL15、PL20這5個(gè)取樣點(diǎn)的表達(dá)量呈現(xiàn)出“低—高—低—高—低”的波動(dòng)性變化規(guī)律。然而，MnCht3A和MnCht3C卻沒有出現(xiàn)這樣的變化規(guī)律。在整個(gè)蛻殼周期的各時(shí)期(A-B、C、D、E)，MnCht1A、MnCht1B、MnCht3B和MnCht4在表皮中的表達(dá)量變化十分明顯，其中蛻殼期的表達(dá)量最高，隨著蛻殼的完成其表達(dá)量也相應(yīng)地下降直至間期無表達(dá)水平被檢測(cè)出來，然后隨著新一輪蛻殼的開始，這四個(gè)基因的表達(dá)量又逐漸升高，雖然

9、MnCht4在蛻殼周期中與其余的3個(gè)基因具有相同的表達(dá)規(guī)律。，但其表達(dá)水平卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于它們。在整個(gè)蛻殼周期的表皮組織中都未檢測(cè)到MnCht3A和MnCht3C的表達(dá)。
　　溫度是影響甲殼動(dòng)物蛻殼的重要因素，當(dāng)甲殼動(dòng)物生活所處的環(huán)境溫度突然發(fā)生變化（溫度的驟升和驟降），常會(huì)引起甲殼動(dòng)物的蛻殼，溫度變化幅度過大還會(huì)造成死亡。本研究以25℃為對(duì)照組（正常組），將生活于25℃轉(zhuǎn)至升溫組(30℃)和降溫組(20℃)中，并對(duì)正常組、升溫組和降溫

10、組中各幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明MnCht1B、MnCht3B和MnCht4三個(gè)基因的表達(dá)量都有顯著性的升高，且升溫組這三個(gè)基因的表達(dá)量較高于降溫組。然而，與正常組相比，MnCht1A在升溫組和降溫組都沒有明顯的變化。MnCht3A和MnCht3C在升溫組、降溫組和正常組的表皮組織中都沒有表達(dá)。
　　綜上所述，由于MnCht3A和MnCht3C在各個(gè)實(shí)驗(yàn)所取的表皮組織中都沒有檢測(cè)到表達(dá)，因此推測(cè)MnCht3A和M