家蠅2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的cDNA克隆及其功能初探.pdf

1、目的：從家蠅的EST測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得家蠅的2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因MDCⅠ、MDCⅡ，對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行cDNA克隆及分子特性分析；探討MDCⅠ、MDCⅡ基因在家蠅不同組織和發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式；初步研究這2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在家蠅免疫防御中的功能。
　　方法：1、MDCⅠ、MDCⅡ的cDNA克隆及序列分析。從課題組前期構(gòu)建的家蠅幼蟲(chóng)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到家蠅的2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因序列，通過(guò)序列分析，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框，根據(jù)其cDNA序列設(shè)計(jì)引

2、物，克隆MDCⅠ、MDCⅡ基因；采用BLAST、EXPASY等生物信息學(xué)分析軟件分析預(yù)測(cè)這兩個(gè)基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位等；從NCBI上下載其他物種相應(yīng)基因的cDNA序列，借助MEGA5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。2、家蠅幾丁質(zhì)酶基因的時(shí)空表達(dá)分析。分別收集家蠅生活史各發(fā)育階段不同蟲(chóng)態(tài)（卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、蛹），成蟲(chóng)不同性別（雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)）的蟲(chóng)體，提取總RNA后合成cDNA,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參

3、基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）技術(shù)檢測(cè)MDCⅠ、MDCⅡ基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異；通過(guò)對(duì)家蠅3齡幼蟲(chóng)的解剖，選擇幼蟲(chóng)的6種具有典型特征的組織器官（脂肪體、唾液腺、中腸、氣管、馬氏管和體壁）。提取相應(yīng)組織的總RNA并合成cDNA。采用Real Time PCR檢測(cè)MDCⅠ、MDCⅡ基因的空間表達(dá)差異。3、幾丁質(zhì)酶基因在家蠅免疫防御中的功能初探。分別將定量的不同病原微生物（白色念珠菌、大腸桿菌和及黃色葡萄球菌）

4、采用注射法導(dǎo)入到家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)，采用Real Time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)（3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h）兩種幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：1、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MDCⅠ的ORF框全長(zhǎng)1512 bp，編碼一個(gè)含503個(gè)氨基酸的蛋白多肽，理論分子量為56801.7Da，等電點(diǎn)為6.83；在蛋白質(zhì)的N端含有一段信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，有6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，具有糖苷水解酶的功能結(jié)構(gòu)域，C

5、端具有幾丁質(zhì)結(jié)合域，以及高度O-糖基化的鏈接區(qū)；MDCⅠ的三級(jí)結(jié)構(gòu)有多個(gè)α螺旋和β折疊，通過(guò)不規(guī)則卷曲相連，進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析果蠅的cht8遺傳距離較近；MDCⅡ基因的ORF框全長(zhǎng)1374 bp，編碼一個(gè)含457個(gè)氨基酸的蛋白多肽，理論分子量為51563.1Da，等電點(diǎn)9.13，與MDCⅠ相同，蛋白質(zhì)N端含有一段信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，具有6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和糖苷水解酶的功能結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，模建的MDCⅡ也有多個(gè)α螺旋和β折疊，

6、通過(guò)不規(guī)則卷曲相連的三維空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析與果蠅成蟲(chóng)盤生長(zhǎng)因子的遺傳距離較近。2、MDCⅠ和MDCⅡ基因在家蠅體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)模式結(jié)果顯示，在家蠅卵、各齡幼蟲(chóng)、蛹和雌雄成蟲(chóng)各階段中，MDCⅠ和MDCⅡ基因均有不同程度的表達(dá)。MDCⅠ基因在2齡幼蟲(chóng)和3齡幼蟲(chóng)內(nèi)表達(dá)量最高，比卵上調(diào)了26.538倍及21.407倍（均具有顯著性差異），雄蟲(chóng)的上調(diào)倍數(shù)比雌蟲(chóng)高，為7.945倍，其表達(dá)水平排列均為2齡幼蟲(chóng)>3齡幼蟲(chóng)>1齡幼蟲(chóng)>雄蟲(chóng)>蛹>雌蟲(chóng)>

7、卵。MDCⅡ基因在2齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)最高，比卵期上調(diào)了65.345倍，3齡幼蟲(chóng)比卵期上調(diào)了30.910倍，其表達(dá)水平從大到小排列與MDCⅠ相同。3、家蠅3齡幼蟲(chóng)的各主要組織中，以體壁作為參照，MDCⅠ基因在唾液腺和中腸中的表達(dá)水平明顯比體壁、氣管和馬氏管高，中腸的表達(dá)水平比體壁上調(diào)77076.32倍，唾液腺比體壁上調(diào)132993.85倍，MDCⅠ基因在各組織表達(dá)量為：唾液腺>中腸>馬氏管>氣管>脂肪體>體壁；MDCⅡ基因在唾液腺和脂肪體中

8、的表達(dá)水平最高，分別是體壁的78260.68倍和5123.81倍，在各組織表達(dá)水平為：唾液腺>脂肪體>馬氏管>中腸>氣管>體壁。4、白色念珠菌誘導(dǎo)后，MDCⅠ和MDCⅡ基因在3h分別上調(diào)116.645倍、127.646倍；金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)后，MDCⅠ基因并未表現(xiàn)出很明顯的上調(diào)，MDCⅡ基因于3h后上調(diào)48.503倍；大腸埃希菌誘導(dǎo)后，MDCⅠ基因3h上調(diào)84.098倍，6h上調(diào)214.376倍，MDCⅡ基因3h上調(diào)73.619倍。