人醇脫氫酶Ⅰ類基因全長(zhǎng)cDNA的克隆、表達(dá)及其應(yīng)用研究.pdf

1、醇脫氫酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)已被發(fā)現(xiàn)存在于很多物種中。哺乳類動(dòng)物的ADH在多種初級(jí)，二級(jí)和芳香族醇類的氧化中發(fā)揮作用，但是其最重要的作用是催化乙醇代謝的初始反應(yīng)，因此在防止乙醇引起的肝損傷方面具有重要意義。人類肝臟Ⅰ類ADH對(duì)乙醇表現(xiàn)高氧化活性，在乙醇代謝中發(fā)揮主要作用。Ⅰ類ADH由ADH1，ADH2和ADH3組成，它們分別由3個(gè)基因編碼。人們對(duì)人及其它多種哺乳動(dòng)物的ADH進(jìn)行了大量研究，取得了突破性進(jìn)展

2、。然而，對(duì)人Ⅰ類ADH在分子組成、結(jié)構(gòu)以及乙醇代謝機(jī)理等領(lǐng)域仍存在相當(dāng)多的疑問。在基因診斷方面，由于過(guò)量飲酒作為各種乙醇相關(guān)疾病主要病因的確立，近年來(lái)對(duì)醇代謝酶遺傳多態(tài)與各乙醇相關(guān)疾病易感性關(guān)系的研究取得了可喜進(jìn)展。然而，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究十分有限，結(jié)果多存在差異甚至矛盾，嚴(yán)重阻礙了其實(shí)際應(yīng)用。 為今后深入探討其分子生物學(xué)特性及其代謝機(jī)理，為初步確定遺傳因素對(duì)我國(guó)東北地區(qū)漢族男性乙醇相關(guān)疾病易感性的影響，從而為本地區(qū)此類疾病的基因檢測(cè)

3、提供可行的方法并為此類疾病今后的預(yù)防控制及病理研究奠定分子基礎(chǔ)，本試驗(yàn)以人Ⅰ類ADH及醇代謝酶多態(tài)基因?yàn)檠芯繉?duì)象進(jìn)行研究。 本試驗(yàn)根據(jù)基因序列的高度同源性設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，利用RT-PCR技術(shù)同時(shí)獲得了人醇脫氫酶Ⅰ類基因全長(zhǎng)cDNA(ADH)克隆。為了鑒定cDNA片段，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異的引物。根據(jù)這對(duì)引物克隆了-4到296的ADH序列，并分別使用KpnⅠ和PstⅠ酶切直接鑒定cDNA序列。獲得的ADH開放閱讀框均為1128bp，編碼

4、375個(gè)氨基酸。與GenBank上已公布的序列比較，證實(shí)獲得的醇脫氫酶為ADH1、ADH2*1和ADH3*2，與已公布序列同源性分別為100％、99.91％和100％；氨基酸序列同源性分別為100％、99.73％和100％。ADH2*1的第946位堿基由G變成A，導(dǎo)致其氨基酸發(fā)生改變，即第316位氨基酸由K變?yōu)镋。 以pTYB11為載體，利用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)成功構(gòu)建了人醇脫氫酶Ⅰ類基因的原核表達(dá)載體，將其導(dǎo)入宿主菌E

5、R2566中獲得表達(dá)。最佳誘導(dǎo)時(shí)間分別為8hr、4hr和6hr，溫度為16℃，IPTG濃度為0.5mmol/L。ADH1、ADH2*1和ADH3*2蛋白表達(dá)量分別占總蛋白的10.2％、11.8％和11.2％。 利用Chitin純化柱分別純化宿主菌ER2566中表達(dá)的ADH1、ADH2*1以及ADH3*2，均獲得了分子量約為40000的目的蛋白。據(jù)測(cè)定，純化的重組酶ADH1、ADH2*1和ADH3*2的蛋白質(zhì)濃度范圍分別是0.08

6、～0.13mg/mL、0.06～0.11mg/mL和0.15～0.20mg/mL。在25℃，pH7.5的100mmol/L磷酸鈉溶液中測(cè)定重組酶的A340nm，以酵母醇脫氫酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，比較計(jì)算三種重組酶制劑的酶活力，結(jié)果ADH1、ADH2*1和ADH3*2的酶活力分別為1.8U/mg、0.9U/mg和1.4U/mg。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了三種重組酶在25℃，pH7.5的100mmol/L磷酸鈉溶液中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)重組酶ADH1、ADH2

7、*1和ADH3*2的Vmax值分別為38min-1、4min-1和32min-1；Km(NAD+)值分別為0.015mmol/L、0.016mmol/L和0.730mmol/L；Km(EtOH)值分別為3.914mmol/L、0.052mmol/L和0.596mmol/L，均具有與肝臟組織分離的ADH相似的動(dòng)力學(xué)特性。 配制不同pH的緩沖液，測(cè)定25℃下，乙醇為底物時(shí)重組酶的酶活力。繪制平均相對(duì)酶活力與pH的關(guān)系曲線，確定ADH

8、1、ADH2*1及ADH3*2催化乙醇代謝反應(yīng)的最適pH值分別為9.5、10.0和9.5。同樣，測(cè)定乙醇為底物時(shí)，重組酶在不同溫度下，100mmol/LpH7.5的磷酸鈉緩沖液中的酶活力。通過(guò)繪制平均相對(duì)酶活力與PH的關(guān)系曲線，確定ADH1、ADH2*1及ADH3*2催化乙醇代謝反應(yīng)的最適溫度為25℃。 分別配制pH值為4.0～12.0的反應(yīng)緩沖液，將重組酶液在4℃上述緩沖液中貯存48hr后，測(cè)定酶活力，與pH7.5，100mm

9、ol/L磷酸鈉緩沖液中儲(chǔ)存酶活力比較，以未儲(chǔ)存的酶活力為100％，繪制平均相對(duì)酶活力與pH的關(guān)系曲線，確定三種重組酶制劑在不同pH下的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種酶制劑在pH8.0～10.0的緩沖液中儲(chǔ)存都較為穩(wěn)定，48hr后可以保存原有酶活力的80％以上。但是當(dāng)pH大于10.0或小于8.0時(shí)，酶活力下降顯著。 將重組酶液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下保溫20min，用100mmol/LpH7.5的磷酸鈉緩沖液配制反應(yīng)試劑

10、，測(cè)定三種重組酶的酶活力，以25℃的酶活力為100％，繪制平均相對(duì)酶活力與溫度的關(guān)系曲線，確定三種重組酶制劑在不同溫度下的穩(wěn)定性。同時(shí)將酶在4℃保存，每24hr測(cè)定一次酶活力，連續(xù)測(cè)定7d，確定三種重組酶制劑在4℃不同時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同溫度保溫20min后測(cè)定的酶活力，與25℃時(shí)的酶活力作比較，在20℃～30℃下保溫酶活力損失不大，可保持原有活力的70％以上，當(dāng)溫度升至30℃以上，酶活力顯著下降，說(shuō)明該類酶對(duì)溫度變化的耐受

11、力很弱。將酶制劑在4℃保存，發(fā)現(xiàn)在4d內(nèi)酶活力活力損失不大，可保持原有活力的75％以上，隨保存時(shí)間的增加，酶活力緩慢下降，7d后酶活力降至原有酶活力的50％左右，說(shuō)明酶制劑在4℃具有較好的穩(wěn)定性。 本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用PCR-RFLP法成功檢測(cè)了東北地區(qū)漢族男性健康者(50例)、嗜酒者(50例)、ALD患者(50例)、AP患者(30例)以及嗜酒CHD患者(50例)中ADH3、ALDH2和CYP2E1的基因型并對(duì)其基因頻率進(jìn)行了比較。結(jié)果