黃連生物堿調(diào)節(jié)高脂C57BL-6J小鼠膽汁酸信號通路和腸道微生物改善血脂異常研究.pdf

1、目的：
　　黃連（Rhizoma Coptidis）為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖。黃連作為降脂藥物一直被廣泛應(yīng)用于臨床治療上。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連及其生物堿的降血脂機(jī)制主要有：增強(qiáng)胰島素受體表達(dá)，降低血糖同時促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成；降低胰島素抵抗、提高胰島素的敏感性；延長低密度脂蛋白受體mRNA半衰期，增加LDLR表達(dá)量；降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，緩解肥胖癥狀；提高機(jī)體抗氧化水平，改善高血脂癥狀。在肝臟與脂代謝相關(guān)的

2、眾多信號通路中，膽汁酸膜受體TGR5（G蛋白偶聯(lián)受體）和膽汁酸核受體 FXR-α吸引了研究者的極大關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)，天然或人工合成的膽汁酸受體激動劑在控制血脂、治療糖尿病、粥樣動脈硬化等代謝異常疾病方面具有良好應(yīng)用前景。目前，天然的膽汁酸受體激動劑只有關(guān)于齊墩果酸的報道。開發(fā)以膽汁酸信號通路為靶標(biāo)的藥物，不僅有助于治療肥胖癥、糖尿病、血脂異常等代謝性疾病，對炎癥反應(yīng)、腫瘤等疾病的治愈也大有裨益。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，口服黃連生物堿的生

3、物利用率小于5%，藥物主要分布大鼠的肝臟、腸道、腦和肺，大部分藥物最終經(jīng)腸道隨糞便排出體外。因此我們推測：黃連生物堿之所以有較好的降脂效果，一方面是由于部分藥物進(jìn)入血液后影響了肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)通路進(jìn)而降低了血脂；另一方面是經(jīng)腸道吸收和排泄的黃連生物堿可作用于腸道微生物，改善血脂水平。尚未見國內(nèi)外報道黃連生物堿能否通過影響膽汁酸受體通路來發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂異常的作用。因此，本研究擬以C57BL/6J小鼠為模型，采用分子生物學(xué)和微生物組學(xué)技術(shù)研究

4、黃連生物堿通過影響膽汁酸受體通路和腸道微生物來改善動物血脂水平的效果和機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　?、叛芯奎S連生物堿對高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)高血脂 C57BL/6J小鼠血脂水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比,高脂高膽固醇（HFHC）飲食導(dǎo)致C57BL/6J小鼠血清中TC、TG、LDL-C，TBA和LPS顯著增加。140 mg/kg?day的巴馬汀，黃連堿，小檗堿和黃連總生物堿（TRAC）灌胃35天能顯著降低小鼠血清中TC、

5、TG、TBA和LPS含量的水平。與HFHC組相比，小檗堿、黃連堿、巴馬汀和黃連總生物堿（TRCA）治療的小鼠血清TC顯著降低了41.5%、48.3%、45.3%和47.5%。與之伴隨的是黃連堿和TRCA處理組中LDLC含量分別降低了11.2%和12.9%（P＜0.05）。黃連堿、巴馬汀和TRCA治療的小鼠血清TG顯著降低32.1%、37.2%和40.1%（P＜0.05）。血清HDLC水平在各治療組有上升趨勢，但與模型組相比無顯著差異。此

6、外，在小檗堿、黃連堿、巴馬汀和 TRCA給藥后，肥胖小鼠的LPS含量分別顯著降低了32.4%、42.3%、31.0%和45.1%。⑵肝臟組織切片油紅O染色檢測黃連生物堿對C57BL/6J小鼠肝臟脂肪沉積的影響；附睪脂肪組織HE染色檢測黃連生物堿對脂肪細(xì)胞大小的影響。定量分析顯示，與高脂模型小鼠相比，灌胃巴馬汀、黃連堿、小檗堿和 TRAC分別減少了28.1%、24.9%、21.2%和26.7%的肝臟甘油三酯含量，并將脂肪細(xì)胞大小降低了37

7、.2%、17.4%、15.6%和22.9%。⑶黃連生物堿對C57BL/6J小鼠肝臟與脂代謝相關(guān)靶標(biāo)mRNA和膽汁酸受體通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃黃連生物堿能夠逆轉(zhuǎn)高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)對FAS、TXNIP、GOT2、APOA4、FXR、EEF1B2、HMGCR、CYP7A1、SREBP2、LDLR、TGR5、ASBT和CYP8B1的mRNA表達(dá)的影響。Western blot對膽汁酸和SREBPs通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

8、檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，黃連堿、小檗堿、巴馬汀和TRCA能激活膽汁酸受體FXR,提高SREBP2、LDLR、CYP7A1、ASBT等相關(guān)蛋白表達(dá)水平，能不同程度的抑制HMGCR和TXNIP的表達(dá)。⑷黃連生物堿對 C57BL/6J小鼠小腸與炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白靶標(biāo)的影響。機(jī)體持續(xù)的炎癥反應(yīng)是肥胖癥的另一個特征。本研究表明與模型組小鼠相比，黃連生物堿治療顯著降低了小鼠附睪脂肪中炎癥因子JNK和TLR4的表達(dá)。在回腸中，TLR4和COX2的表達(dá)在

9、高脂血癥小鼠中升高，黃連生物堿治療同樣降低了小鼠回腸中這兩種細(xì)胞炎癥因子。⑸黃連生物堿對 C57BL/6J小鼠體內(nèi)膽汁酸肝腸循環(huán)的影響。高脂高膽固醇飲食導(dǎo)致小鼠血清和肝臟中的膽汁酸含量升高，黃連生物堿能有效降低小鼠血清中的膽汁酸，增加糞便中的膽汁酸含量。機(jī)理研究顯示，黃連生物堿能顯著提高肝臟中膽汁酸合成限速酶-CYP7A1的表達(dá)；可上調(diào)負(fù)責(zé)將膽汁酸從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到膽管系統(tǒng)的 BSEP的表達(dá)。在回腸中，黃連生物堿顯著增加了 ASBT的表達(dá)，

10、使得膽汁酸的重吸收量增加，最終這些膽汁酸被轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟。上述生理變化促進(jìn)了膽汁酸的腸肝循環(huán)和脂質(zhì)消化。此外，黃連生物堿顯著降低了小鼠回腸中的緊密連接蛋白Occludin和 Claudin1的表達(dá)，使腸道通透性增加，進(jìn)而促進(jìn)了膽汁酸的糞便排泄，降低了高血脂小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)含量。⑹黃連生物堿對C57BL/6J小鼠腸道菌群的影響。使用16S rRNA基因測序方法，檢測高脂高膽固醇飲食和黃連生物堿對小鼠腸道菌群的影響。從32個糞便樣品獲得了1442

11、18個可用的焦磷酸測序讀數(shù)，總共鑒定了106種微生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn) HFHC組小鼠體內(nèi)檢測到的微生物總數(shù)均低于正常模型組和給藥組小鼠。表明黃連生物堿治療避免了肥胖小鼠腸道微生物的多樣性下降，且有利于在 HFHC飲食動物體內(nèi)維持穩(wěn)定和健康的細(xì)菌群落。在種水平上，本研究首次報道了黃連生物堿治療能明顯降低Desulfovibrio C21_c20、Parabacteroides distasonis和大腸桿菌在高血脂小鼠腸道內(nèi)的豐度；相反，小檗堿

12、、黃連堿、巴馬汀和 TRCA顯著增加了小鼠腸道內(nèi) Akkermansia muciniphila，Sporobacter termitidis和 Alcaligenes faecalis的豐度?；赨niFrac法聚類分析的結(jié)果同樣證明黃連生物堿能夠恢復(fù)由高脂高膽固醇飲食所造成的腸道微生物菌群失衡。⑺微生物與細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建及腸道微生物在脂代謝中作用探討。建立了細(xì)胞和腸道微生物共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示 Alcaligenes faeca

13、lis和 Escherichia coli與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)能對細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生“相似而又不同”的作用。即Alcaligenes faecalis和 Escherichia coli都能影響HepG2細(xì)胞中的脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)。然而，這兩種細(xì)菌對相同靶標(biāo)的影響作用則差異很大。Escherichia coli細(xì)菌能劑量依賴性地將 CYP7A1、ASBT的表達(dá)提高。而 Alcaligenes faecalis顯示出相反的趨勢

14、。 Alcaligenes faecalis和 Escherichia coli共培養(yǎng)均提高了HepG2細(xì)胞中的FXR水平，但兩種菌株的FXR上調(diào)活性隨濃度的增加而降低。此外，Escherichia coli劑量依賴性地抑制了HepG2細(xì)胞中LDLR和HMGCR的表達(dá)。三種濃度下的Alcaligenes faecalis顯著降低了HMGCR水平。至于SREBP2，只有Escherichia coli能提高該蛋白的表達(dá)，在相同條件下用Al