EGF-EGFR介導(dǎo)ALC1促肝癌細胞惡性表型轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景與目的：
　　肝細胞癌發(fā)病率及死亡率高，是世界公認的最常見的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌和胃癌，5年生存率僅為5％左右。HCC發(fā)病隱匿，病程進展快、早期診斷困難，對放化療不敏感。過去的幾十年在肝細胞癌的治療方面取得了一定的進展，但是依然無法解決肝癌易復(fù)發(fā)和5年生存率低等問題。因此有效阻斷肝癌進展和尋找特異性治療方法依然是目前亟待解決的問題。ALC1基因位于染色體1q21，有一個SNF2_N結(jié)構(gòu)域和解旋酶超家族結(jié)構(gòu)域，編碼

2、897個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。研究表明在肝癌、肺癌和胃癌等實體瘤中高表達，與腫瘤預(yù)后正相關(guān)，另有研究報道ALC1在胚胎干細胞、成體干細胞中均有表達，與細胞的增殖分化密切相關(guān)，故以ALC1為靶標的治療存在局限性。表皮生長因子（EGF）是強力細胞分裂促進因子，與胚胎發(fā)生發(fā)育、組織再生修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等過程有關(guān)。EGF通過與其受體EGFR結(jié)合激活下游信號通路而發(fā)揮作用。大量研究證明EGFR在多種腫瘤組織中有高表達，EGFR特異性阻斷劑在乳腺癌、

3、肺癌的靶向治療中療效顯著，但是否適用于其它類別腫瘤如肝癌的治療仍未有定論。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)干擾ALC1可抑制MEK下游信號通路活性,提示ALC1與EGF/EGFR信號通路作用有重疊，但ALC1與EGFR之間是否存在關(guān)聯(lián)目前尚不清楚，本文擬對此進行深入探討。
　　方法：
　　1、采用肝癌組織相鄰切片的免疫組織化學(xué)方法及免疫熒光雙標技術(shù)檢測臨床肝癌標本（肝癌及癌旁組織芯片）及肝癌細胞系A(chǔ)LC1與EGFR表達及定位；ALC1與

4、EGFR表達的相關(guān)性分析。
　　2、熒光實時定量PCR及Westernblot方法檢測EGF對肝癌BEL-7402和QGY-7703細胞ALC1表達的影響。
　　3、平板克隆、MTS、細胞劃痕及Transwell等實驗觀察EGF/EGFR信號對ALC1促肝癌BEL-7402和QGY-7703細胞惡性表型作用的影響，探討EGF/EGFR信號與ALC1表達的關(guān)系。
　　4、用EGF處理ALC1敲減細胞株8024-shALC

5、1及其對照組8024-shCtr細胞,Westernblot方法檢測EGF對ALC1及EGF/EGFR下游信號分子MEK和ERK的影響；細胞生物學(xué)表型檢測驗證EGF/EGFR對ALC1促肝癌細胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性表型特征的介導(dǎo)作用。
　　結(jié)果：
　　1、肝癌組織芯片免疫組織化學(xué)檢測顯示ALC1陽性表達率為64.8%(35/54)，EGFR陽性表達率為70%(38/54)，ALC1和EGFR共表達率

6、為51.8%，兩者的表達呈正相關(guān)（r=0.662,P＜0.05）。免疫熒光雙標記顯示肝癌BEL-7402和QGY-7703中有ALC1與EGFR的共表達。
　　2.肝癌SMMC-7721、Huh7、HepG2、BEL-7402、CRL-8024和QGY-7703細胞均有ALC1的表達；EGF處理30分鐘后BEL-7402和QGY-7703細胞即有ALC1表達增強；
　　3.當(dāng)用EGFR抑制劑Afatinib阻斷EGFR后給予

7、EGF處理，BEL-7402和QGY-7703細胞ALC1表達水平均明顯低于EGF處理組；MTS、平板克隆實驗、劃痕實驗及EMT相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示EGF可明顯促進BEL-7402和QGY-7703細胞的增殖、侵襲及遷移，促進EMT相關(guān)蛋白表達變化；阻斷EGFR后給予EGF對BEL-7402和QGY-7703細胞的增殖、遷移、EMT相關(guān)蛋白表達等無明顯影響。
　　4.EGF處理ALC1敲減細胞株8024-shCtr/8024-AL

8、C1shRNA細胞，結(jié)果顯示ALC1表達水平與EGF/EGFR下游信號分子MEK和ERK的磷酸化程度有關(guān)；用EGF處理8024-ALC1shRNA細胞可明顯回調(diào)其ALC1表達，同時促進細胞的增殖、遷移和侵襲作用，與8024-shCtr組相比差別有顯著性意義（P＜0.05）。敲減ALC1所致的細胞表型特征改變?nèi)鏓-Cadherin高表達、N-Cadherin及Vimentin低表達可因EGF處理而回調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、肝