柴胡皂甙-d逆轉(zhuǎn)人肝癌HepG2細(xì)胞惡性表型的研究.pdf

1、目的：
　　 以柴胡(Bupleurun Chinese DC,BCDC)為主要成分的中藥復(fù)方在肝癌的防治研究中顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。柴胡皂甙-d(Saikosaponin-d,SSd)是從柴胡中提取的主要活性成分,研究表明其具有抑制胃癌、肺癌細(xì)胞增殖的作用,但對(duì)肝癌細(xì)胞作用的研究報(bào)道甚少。本研究旨在探討SSd逆轉(zhuǎn)人肝癌HepG2細(xì)胞惡性表型的作用及其機(jī)制,為SSd在肝癌防治中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：<

2、br>　　 1.實(shí)驗(yàn)分組
　　 常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,接種96孔板,隨機(jī)分為五組:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)組:即SSd處理組,分別經(jīng)2.5、5.0、10、20mg/L四組濃度SSd處理人肝癌HepG2細(xì)胞24、48和72h。四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法觀察SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響,選擇其作用最明顯的劑量和時(shí)間作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理因素。
　　 (2)對(duì)照組:用不含SSd的培養(yǎng)液處理He

3、pG2細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組相同時(shí)間。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)MTT比色法觀察SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響;
　　 (2)流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測(cè)SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞周期分布的影響;
　　 (3)倒置相差顯微鏡觀察SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;
　　 (4)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞上清液中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)濃

4、度;放免法檢測(cè)細(xì)胞上清液中白蛋白(Albumin,ALB)的濃度,觀察SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生化功能的影響;
　　 (5)通過(guò)transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察SSd對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響;(6)RT-PCR檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞p27基因mRNA表達(dá)的變化以探討SSd逆轉(zhuǎn)人肝癌HepG2細(xì)胞惡性表型的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的SSd處理HepG2細(xì)胞24、48、72h后,其抑制

5、率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng):當(dāng)SSd作用48h時(shí),隨SSd濃度的增加其抑制作用也增強(qiáng),以10mg/L的抑制率最高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表現(xiàn)出一定的劑量-時(shí)間依賴性效應(yīng)。
　　 2.10mg/L的SSd作用人肝癌HepG2細(xì)胞48h(實(shí)驗(yàn)組),其細(xì)胞周期的分布發(fā)生明顯改變。實(shí)驗(yàn)組:G1期:69.43±3.01、S期:22.3±0.82;對(duì)照組:G1期:62.83±2.72、S期:27.23±0.59。

6、兩組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3.10mg/L的SSd作用48h后,人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)傾向于正常分化,細(xì)胞形態(tài)變小、變圓,核變小、變圓或卵圓形,核/漿比例縮小、核仁變少、變淡或不明顯(見(jiàn)第二部分圖3.1)。
　　 4.經(jīng)10mg/L的SSd處理后,實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞上清液中ALB和AFP的含量發(fā)生明顯變化。實(shí)驗(yàn)組:ALB:31.1±4.9mg/L、AFP.70.3±5.7mg/L:對(duì)照組:ALB:24.7

7、±2.8mg/L、AFP:118.2±15.6mg/L。兩組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.經(jīng)10mg/L的SSd處理后,實(shí)驗(yàn)組人肝癌HepG2細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組HepG2細(xì)胞明顯減少,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6.RT-PCR結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞p27基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.566、對(duì)照組HepG2細(xì)胞p27基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.335,兩者

8、之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.SSd具有抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用,在一定濃度范圍內(nèi),其作用具有濃度.時(shí)間依賴性效應(yīng);SSd可使HepG2細(xì)胞周期阻滯于G1期,此可能為SSd抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的重要途徑之一。
　　 2.SSd處理人肝癌HepG2細(xì)胞后,細(xì)胞向正常形態(tài)分化。與對(duì)照組比較,HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP的濃度明顯降低、ALB升高、細(xì)胞遷移能力減弱,差