波形蛋白影響肝癌細(xì)胞惡性表型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：癌細(xì)胞表達(dá)波形蛋白(vimentin，VIM)在臨床上傾向?yàn)榛颊哳A(yù)后差的一個生物標(biāo)志，但波形蛋白對腫瘤生物學(xué)功的影響仍存在明顯的爭議。本研究的主要目的是闡明波形蛋白與肝癌細(xì)胞惡性表型的相互關(guān)系及其機(jī)理。 方法：將波形蛋白基因開放閱讀框(open reading frame，ORF，1401bp)克隆到質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)，重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株，波形蛋白的表達(dá)通過RT-PCR和流式細(xì)

2、胞術(shù)測定。分別用細(xì)胞增殖試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)的被覆基質(zhì)膠侵襲小室判斷癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲潛能，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。將野生型和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞裸鼠皮下接種，觀測其成瘤性的差異。移植瘤組織末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測凋亡，通過免疫組織化學(xué)探測移植腫瘤組織中與腫瘤生物表型有關(guān)的一些因子的表達(dá)水平。以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VIM作為基因疫苗免疫BALB/c小鼠，觀測其對纖維肉瘤細(xì)胞MethA和骨髓

3、瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag14移植瘤的免疫療效。 結(jié)果：DNA序列分析和限制性核酸內(nèi)切酶消化證實(shí)重組載體己正確克隆，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2-pV波形蛋白基因在RNA和蛋白水平均高表達(dá)；經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示HepG2-pV細(xì)胞的增殖、侵襲力和裸鼠皮下移植瘤生長速度均降低，癌細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞周期受阻于DNA合成期(S期)。在選用的14種抗體免疫組織化學(xué)染色中，與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HepG2-p細(xì)胞移植瘤組織比較，HepG2-pV細(xì)胞

4、移植瘤免疫組織化學(xué)顯示波形蛋白、Bcl-2和Caspase-3染色增強(qiáng)而PCNA和CD44染色減弱。用pcDNA3.1-VIM作為異種同源基因疫苗對間葉性腫瘤的免疫治療無效。 結(jié)論：構(gòu)建了重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-VIM和建立了穩(wěn)定高表達(dá)波形蛋白的癌細(xì)胞株HepG2-pV，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞表達(dá)波形蛋白擾亂了細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)，引起癌細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞周期阻滯和一些與腫瘤生長侵襲有關(guān)的蛋白表達(dá)水平的改變，從而抑制其惡性表型。提示波形蛋