Gitelman綜合征診斷方法的建立及維生素D阻斷其腎素活化機(jī)制初探.pdf

1、目的:
　　Gitelman綜合征(GS)由SLC12A3基因突變導(dǎo)致其編碼的腎臟遠(yuǎn)曲小管鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NCC)功能失活，是一種遺傳性失鹽性腎病，臨床表現(xiàn)為低血鉀、低血鎂、代謝性堿中毒、低尿鈣和腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)活化，但血壓正常。目前臨床上尚缺乏簡(jiǎn)單易行的診斷方法，限制了該病診治水平的提高。
　　本研究擬建立GS患者臨床、基因和生理功能（氫氯噻嗪試驗(yàn)）診斷方法，結(jié)合體外基因突變功能試驗(yàn)，驗(yàn)證中國(guó)人

2、群GS患者的常見(jiàn)和部分新突變的致病性;觀察GS患者正常血鎂亞型和糖耐量低減的表型。觀察GS患者全身和局部RAAS活化及可能機(jī)制，探討維生素D及其類(lèi)似物抑制腎素的作用。
　　方法:
　　1.制定臨床癥狀標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷、收集病例資料，提取外周血DNA，行SLC12A3基因外顯子直接測(cè)序，氫氯噻嗪實(shí)驗(yàn)評(píng)估患者NCC蛋白功能狀態(tài)?？偨Y(jié)中國(guó)人高頻和新發(fā)突變，構(gòu)建野生型和突變型NCC質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄成cRNA并進(jìn)行顯微注射，用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體

3、系定量驗(yàn)證新突變功能。
　　2.檢測(cè)GS患者血、尿電解質(zhì)水平（對(duì)照組為64位健康受試者）。行3h OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)GS患者的胰島素敏感性和胰島分泌功能，對(duì)照組為健康受試者(n=20)和糖尿病患者(n=20)。
　　3.分析低鎂血癥和正常血鎂GS患者的臨床特點(diǎn)、NCC功能試驗(yàn)差異，免疫組化法檢測(cè)腎活檢組織鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族M成員6(TRPM6)表達(dá)水平。
　　4.RAAS臥立位實(shí)驗(yàn)測(cè)定GS患

4、者全身血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ和醛固酮水平，免疫組化和熒光雙染觀察GS患者和胚胎腎組織中腎素產(chǎn)生細(xì)胞再募集現(xiàn)象。
　　5.急性和慢性注射VDR激動(dòng)劑，觀察血漿腎素活性、腎組織腎素mRNA和蛋白的變化，觀察VDR基因敲除小鼠腎素、環(huán)氧酶2(COX2)、NCC和TRPM6水平。體外實(shí)驗(yàn)觀察VDR是否在球旁器顆粒細(xì)胞(JG)或致密斑(MD)細(xì)胞表達(dá)，并探究活性維生素D對(duì)低氯誘導(dǎo)的MD細(xì)胞COX2高表達(dá)的影響。
　　結(jié)果

5、:
　　1.60位確診的GS患者常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為肌無(wú)力(79.7％)、乏力(55.9％)、手足痙攣或抽搐(45.8％)、心悸(40.7％)、感覺(jué)異常(35.6％)和夜尿增多(33.9％)，且男性GS患者的臨床表現(xiàn)較女性患者重。
　　2.54種突變中含14種新突變，中國(guó)GS患者突變頻率高于5％的突變?yōu)門(mén)60M、D486N和R913Q。體外功能實(shí)驗(yàn)證明突變型NCC(T60M，L215F, D486N，N534K，Q617R和R9

6、28C)攝取22Na+的能力均顯著低于野生型，且突變型NCC轉(zhuǎn)運(yùn)活性的下降是由轉(zhuǎn)運(yùn)子特異性突變所致。
　　3.建立了簡(jiǎn)化氫氯噻嗪實(shí)驗(yàn)診斷方法，確定了中國(guó)人群正常值范圍，用于臨床證實(shí)GS患者NCC蛋白功能受損。使用氫氯噻嗪前后氯排泄分?jǐn)?shù)凈增加值來(lái)診斷GS的ROC曲線下面積為0.983，取2.86作為截點(diǎn)，以基因診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)診斷低鉀、堿中毒GS患者的靈敏度為95％，特異度為95.2％。
　　4.OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GS患

7、者存在糖代謝和胰島素功能異常，與健康對(duì)照相比，GS患者表現(xiàn)為血糖和胰島素分泌高峰延遲，血糖曲線下面積增加，胰島素分泌敏感性指數(shù)(ISSI)降低，而胰島素敏感性指標(biāo)（ISOGTT、QUICKI和HOMA-IR）無(wú)顯著差異。
　　5.正常血鎂患者臨床表現(xiàn)較低鎂血癥患者輕，對(duì)氫氯噻嗪的反應(yīng)好于低鎂血癥患者。NCC和TRPM6同時(shí)表達(dá)在腎臟遠(yuǎn)曲小管。正常血鎂患者(n=2)遠(yuǎn)曲小管TRPM6表達(dá)水平與輕微病變對(duì)照組(n=14)無(wú)顯著差異(7

8、.82±5.23％ vs.8.63±2.67％，p＞0.05)，而低鎂血癥GS患者(n=10) TRPM6表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(4.96±1.88％vs.8.63±2.67％,p=0.001)。
　　6.88％的GS患者存在全身RAAS活化，GS患者(n=18)腎組織球旁器增生，腎素表達(dá)水平顯著高于輕微病變對(duì)照組，球旁器和微動(dòng)脈區(qū)域均發(fā)現(xiàn)了腎素與α-Actin共表達(dá)現(xiàn)象，重現(xiàn)了胚胎階段腎組織的情況。
　　7.活性維生素D及

9、其類(lèi)似物均不能抑制急性腎素分泌，但腹腔注射兩周其類(lèi)似物--RO化合物可抑制腎素mRNA表達(dá)，且不升高血鈣。VDR基因敲除小鼠血鈣降低，腎素mRNA表達(dá)增加2.9倍。MD細(xì)胞表達(dá)VDR，活性維生素D不能抑制低氯誘導(dǎo)的MD細(xì)胞COX2高表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　建立了GS臨床、基因和生理功能試驗(yàn)（氫氯噻嗪試驗(yàn)）診斷模型。氫氯噻嗪實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的GS診斷和鑒別診斷方法。新發(fā)現(xiàn)了14種突變，明確了中國(guó)GS患者的高頻突變包括