活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細胞瘤血管生長中的評估作用.pdf

1、第一部分穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白膠質(zhì)母細胞瘤細胞株建立及生物學特性評價
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)人膠質(zhì)母細胞瘤，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)后，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的細胞株GBM-EGFP，并對其生物學特性進行評價。
　　方法：
　　通過慢病毒載體將攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green flurescent protein EGFP）慢病毒轉(zhuǎn)染原代GBM細胞株，并進行篩選和擴大培養(yǎng)，構(gòu)建出穩(wěn)定表

2、達EGFP的單細胞克隆株：GBM-EGFP。體外經(jīng)10次傳代后流式細胞分析檢測細胞株熒光表達的穩(wěn)定性；對GBM及GBM-EGFP兩種細胞株在生長周期，細胞生長曲線，侵襲性，VEGF的表達及裸鼠皮下成瘤方面進行觀察，觀察經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后構(gòu)建的細胞株GBM-EGFP較原代細胞的生物學特性是否發(fā)生改變。
　　結(jié)果：
　　通過慢病毒介導轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細胞瘤，通過篩選及單克隆建立GBM-EGFP細胞株，能夠在體外穩(wěn)定持續(xù)表達綠色熒光蛋白。經(jīng)

3、過30天體外培養(yǎng)后，能高效穩(wěn)定表達綠色熒光，流式分析檢測表達率為84％；細胞形態(tài)較原代細胞未發(fā)生改變。GBM-EGFP細胞株生長曲線、細胞周期、侵襲能力與未轉(zhuǎn)染的原代GBM一致。將GBM-EGFP細胞注入BALB/c-nu小鼠皮下，分別建立GBM及GBM-EGFP裸鼠皮下模型，顯示兩者在成瘤率、腫瘤生長趨勢方面及腫瘤組織形態(tài)學上無差異。
　　結(jié)論：
　　通過慢病毒載體介導的轉(zhuǎn)染方法建立起來的GBM-EGFP細胞株能穩(wěn)定高效表

4、達綠色熒光蛋白，細胞生物學特性與母系GBM基本一致，為研究膠質(zhì)瘤的復發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了一個良好的工具。
　　第二部分活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細胞瘤血管生長中的評估作用
　　目的：
　　通過活體成像系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的膠質(zhì)母細胞瘤皮下腫瘤模型，動態(tài)觀察腫瘤生長及血管生成，分析兩者之間的關(guān)系，從而為研究膠質(zhì)母細胞瘤的轉(zhuǎn)移復發(fā)，評估靶向治療提供有效的動物模型。
　　方法：
　　建立小鼠皮下腫瘤模型：取25只裸鼠

5、隨機分成5組，于4周齡大小時皮下注射1x106個GBM-EGFP細胞。另取9只作為對照組，注射1 x106個GBM細胞，分別于1w，1.5 w，2w，2.5w，3 w，3.5w，4 w，4.5w，5 w時以活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腫瘤熒光表達情況，測定熒光值（以光子數(shù)表示）。并于活體成像后取實驗組及參照組裸鼠各一只取腫瘤組織行H&E染色及人CD34免疫組化(IH)觀察腫瘤血管發(fā)生及形態(tài)，統(tǒng)計微血管密度（MVD），同時行CD34免疫熒光(IF

6、)觀察腫瘤來源內(nèi)皮細胞。體外取不同細胞濃度的細胞送活體成像系統(tǒng)，分析不同濃度細胞與熒光值之間的關(guān)系，用以計算腫瘤不同時間段腫瘤內(nèi)細胞數(shù)，從而分析腫瘤生長與血管發(fā)生及血管形態(tài)之間的關(guān)系，最后以流式加以驗證。
　　結(jié)果：
　　體外實驗顯示GBM-EGFP熒光表達穩(wěn)定，且熒光強度與細胞數(shù)呈直線正相關(guān)。小鼠活體成像系統(tǒng)顯示接種后1w后腫瘤可在活體成像系統(tǒng)中觀察到熒光，熒光表達隨腫瘤生長逐漸增強。H&E染色及免疫組化顯示腫瘤接種后3d

7、開始出現(xiàn)幼稚血管，1 w開始腫瘤中央開始壞死，壞死周圍出現(xiàn)血管出芽結(jié)構(gòu)，MVD在3-4w時增值最快，4w達到峰值，此后進入平臺期，流式結(jié)果分析顯示4w時CD34+陽性率為1.63%。
　　結(jié)論：通過活體成像系統(tǒng)可建立穩(wěn)定表達綠色熒光的膠質(zhì)瘤皮下腫瘤模型，實現(xiàn)了對膠質(zhì)瘤體外生長的長期動態(tài)觀察，為研究膠質(zhì)瘤的體外生長提供了良好模型；同時通過免疫熒光觀察到腫瘤來源的內(nèi)皮細胞，統(tǒng)計了MVD，并以流式加以驗證，為腫瘤來源內(nèi)皮細胞分選創(chuàng)造了條